霧化吸入滅活草分枝桿菌對膿毒癥急性肺損傷大鼠精氨酸甲基轉移酶—1表達的影響

齊心欣　顧忠民　陳超

【摘要】 目的：觀察膿毒癥肺損傷大鼠肺組織精氨酸甲基轉移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM-1）、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）、血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）的水平，探討霧化吸入滅活草分枝桿菌治療膿毒癥肺損傷機制。方法：選取48只清潔級健康雄性Wistar大鼠隨機分成假手術組（Sham組）、膿毒癥肺損傷組（CLP組）、草分枝桿菌F.U.36注射液霧化吸入治療組（F.U.36組），每組16只，于術后24、48 h分別檢測HMGB1、PCT濃度及免疫組織化學檢測CARM-1、NF-κB表達，光鏡觀察肺組織病理變化。結果：CLP組術后48 h死亡2只，F.U.36組術后48 h死亡1只，Sham組無死亡；CLP、F.U.36組術后24、48 h時的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均高于Sham組，比較差異均有統計學意義（P<0.01）；F.U.36組術后24、48 h時的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均顯著低于CLP組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；光鏡下CLP組和F.U.36組可見肺損傷，CLP組較F.U.36組損傷明顯。結論：霧化吸入滅活草分枝桿菌可降低膿毒癥肺損傷時相關炎癥因子水平，對肺有保護作用。

【關鍵詞】 滅活草分枝桿菌； 膿毒癥； 肺損傷； 精氨酸甲基轉移酶-1

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.080 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）16-0-03

膿毒癥常引起急性肺損傷，其臨床病死率高，目前認為與多種炎癥介質有關，但發病機制仍未明確[1]。精氨酸甲基轉移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1 CARM-1）是蛋白質精氨酸甲基轉移酶11個家族成員之一，目前發現其與心血管、呼吸等多種疾病有關[2]，但其在膿毒癥肺損傷中的作用未見報道。研究認為草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.ph）細胞壁、多糖等成分有免疫調節功能，草分枝桿菌F.U.36注射液作為滅活M.Ph制劑，目前已應用于臨床[3]，但其是否可減輕膿毒癥肺損傷，目前未見報道。故筆者通過實驗比較膿毒癥肺損傷大鼠霧化吸入草分枝桿菌F.U.36注射液后，肺組織CARM-1、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）及血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）的水平變化，探討其減輕膿毒癥大鼠肺損傷機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

48只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重（190±20）g（上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK滬，2012-0002），利用隨機數字表獲取隨機數字，按1∶1∶1隨機分三組，即假手術組（Sham組）、膿毒癥肺損傷組（CLP組）、草分枝桿菌F.U.36注射液霧化吸入治療組（F.U.36組），每組16只。

1.2 試劑及儀器

草分枝桿菌F.U.36注射液（成都金星健康藥業公司，規格1.72 μg/支），大鼠CARM-1、NF-κB及DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），大鼠HMGB1及PCT試劑盒（上海酶聯生物科技公司），10%水合氯醛溶液及10%甲醛溶液（上海江萊生物公司），空氣壓縮式霧化吸入治療器（廣東粵華醫療器械廠，型號WH-2000），電動玻璃勻漿器（寧波新芝，型號DY89-1），離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司，型號TD5A），酶標儀（美國AWARENESS公司，型號Stat Fax 2100），石蠟切片機（浙江金華益迪試驗器材，型號YD-315），光學顯微鏡（廈門麥克奧迪公司，型號BA-210T）等。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 參考Carpenter等[4]實驗并予改進：將大鼠置入除底蓋的礦泉水瓶中，露頭于瓶頸外，尾端封上；向霧化器藥杯中加人5 ml生理鹽水（CLP組和Sham組）、草分枝桿菌F.U.36注射液（按照60 kg體重成人用量1.72 μg換算成大鼠等效劑量0.172 μg/kg，稀釋于5 ml生理鹽水）（F.U.36組），將霧化器給藥管扣住大鼠口鼻霧化，直至藥液霧化完，約需30 min[4]。各組霧化1次/d，連續霧化5 d。

1.3.2 模型制作 各組大鼠在最后一次霧化結束后24 h行膿毒癥造模，參照Hubbard等方法：CLP組和F.U.36組予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于腹正中做長2 cm的手術切口進入腹腔，將盲腸拉出，絲線結扎盲腸中段，扎線下0.5 cm處用國產25號針頭穿透腸壁1次，形成漏口兩處，擠壓糞便流出，將盲腸回納，逐層縫合關腹[5]。Sham組同法麻醉后開、關腹，不予盲腸結扎穿孔。三組術后均皮下注射平衡液50 ml/kg，術后正常飲水、進食。

1.3.3 標本采集 術后24、48 h三組各取8只大鼠麻醉后開腹抽取腹腔動脈血1 ml，待自然凝固后于1 h內3 000 r/min離心15 min，分離上層血清置-80 ℃冰箱保存待測PCT；開胸腔，完全分離肺部，取80mg肺組織制成勻漿，3 000 r/min離心15 min后分離上清液置-80 ℃冰箱保存以測HMGB1；取部分肺組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，常規脫水、石蠟包埋切片以待免疫組織化學檢測CARM-1、NF-κB和病理檢查。

1.3.4 觀察項目與檢測方法 （1）大鼠肺組織HMGB1及血清PCT濃度測定：嚴格按照各試劑盒說明書要求，采用ELISA方法檢測。（2）大鼠肺組織CARM-1、NF-κB免疫組織化學檢測：取肺組織石蠟切片，予脫蠟、熱修復抗原，孵育一抗，4 ℃過夜，孵育二抗，DAB顯色，各級酒精（60-100%）脫水，封片，光鏡觀察免疫組織化學反應的強度及分布；通過IPP6.0圖像分析軟件，計算各組CARM-1、NF-κB的平均吸光度值（A值）。（3）大鼠肺組織病理學檢查：取肺組織石蠟切片，脫蠟后行HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺病理結構改變。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

CLP組死亡2只（術后48 h死亡2只），F.U.36組死亡1只（術后48 h死亡1只），Sham組無死亡。死亡原因與膿毒癥大鼠盲腸缺血壞死面積、腹腔滲出多、感染重等有關。

2.2 三組大鼠術后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度比較

三組大鼠術后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度比較差異均有統計學意義（P<0.05）。CLP、F.U.36組術后24、48 h時PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均高于Sham組，比較差異均有統計學意義（P<0.01）；F.U.36組術后24、48 h時PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均顯著低于CLP組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 三組大鼠肺組織病理分析

Sham組大鼠肺組織結構完整，上皮細胞排列緊密，未見腫脹、壞死；CLP組可見上皮細胞排列紊亂伴壞死，大量炎性細胞浸潤，肺泡內細胞滲出；F.U.36組上皮細胞變性壞死程度較輕，炎性細胞浸潤相對較輕，肺泡滲出較輕，見圖1、圖2。

3 討論

研究證實滅活M.Ph及其活性組分通過模式識別受體信號通路，影響免疫細胞功能基因表達[3]。相關研究提示霧化吸入草分枝桿菌F.U.36可改善支氣管哮喘氣道炎癥反應[6]，其具有用藥劑量小、副作用少等特點，而是否減輕膿毒癥肺損傷反應目前未見報道，故本實驗予以探討。

PCT已成為膿毒癥診斷指標之一，近來研究提示其與嚴重感染的臟器功能障礙程度相關[7]。本研究發現CLP組PCT水平明顯增高，同期肺組織病理損傷明顯，提示血清PCT水平高低反映出膿毒癥肺損傷病情。F.U.36治療組PCT水平較CLP組顯著下降，肺部損傷較輕，提示霧化吸入草分枝桿菌F.U.36可下調其水平而減輕膿毒癥肺損害。

研究認為胞外HMGB1可激活多種炎性細胞，加重組織壞死，是膿毒癥重要的晚期炎癥因子[8]，但其在膿毒癥肺損傷中的作用研究極少。本研究發現CLP組HMGB1水平顯著上升，同期肺病變嚴重，提示其參與了膿毒癥肺損傷過程。目前認為HMGB1阻斷療法能減輕敗血癥、缺血再灌注損傷等疾病模型病情，可能成為治療炎癥和自身免疫疾病新方向[9]。本研究發現草分枝桿菌F.U.36可下調HMGB1水平從而改善肺部病情。

CARM-1在胞內信號轉導、轉錄因子調控、細胞凋亡等方面發揮重要作用，目前研究發現其在支氣管哮喘、肺癌等疾病的發展中扮演重要角色[10]。研究發現CARM-1是NF-κB激活的必需因子，其啟動了胞內NF-κB信號傳導通路，促進炎性基因表達[11]。本實驗發現CLP組CARM-1及NF-κB水平明顯增高，同期肺病變明顯，提示二者參與了膿毒癥肺損傷過程。F.U.36組二者水平有明顯下降，肺部病變較輕，提示草分枝桿菌F.U.36可下調其水平而減輕膿毒癥性肺損害。

研究發現HMGB1通過與TLR4結合，激活下游NF-κB誘導各種炎癥因子的釋放，NF-κB為重要的早期炎性因子，其與晚期炎性因子HMGB1在膿毒癥的發展過程中存在正反饋機制[12]。本實驗觀察到CLP組HMGB1因子和信號通路蛋白CARM-1及NF-κB濃度明顯增高，提示膿毒癥時相關因子協同促進了肺損傷過程，而草分枝桿菌F.U.36通過降低相關因子水平減輕了膿毒癥肺損傷。

本研究提示膿毒癥急性肺損傷時，血清PCT、肺內HMGB1等炎癥因子水平增高，肺內CARM-1、NF-κB等炎癥信號傳導因子表達增強，提示相關因子參予了膿毒癥肺損傷過程，炎癥因子與通路蛋白間存在正反饋關系。霧化吸入滅活草分枝桿菌通過降低膿毒癥相關炎癥因子及通路蛋白水平而起到減輕肺損害作用。

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（收稿日期：2017-12-28）