嗜酸乳桿菌NX2-6細菌素 在豬肉保鮮上的應用

周 艷,曾維偉,朱筱玉,呂鳳霞,別小妹,趙海珍,陸兆新

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

乳酸菌產抑菌物質總體來說是由酸性物質、細菌素、二氧化碳、過氧化氫、雙乙酰、類細菌素等組成的復雜體系[1-4]。其中,細菌素近年來受到了廣泛的關注,但其主要應用于果蔬及水產,在冷鮮肉中應用較少。Anacarso等[5]從火腿中分離的植物乳桿菌所產細菌素具有良好的抗腐敗菌和致病菌活性。Shelegueda[6]獲得的一株腸球菌產細菌素與殼聚糖、乳酸鈉共同作用能夠抑制魚體中嗜冷菌群的生長。Zhou[7]指出，一株乳酸桿菌產細菌素能抑制草莓灰霉病孢子萌發。Shi等[8]研究發現，明串珠菌K7產細菌素能夠有效抑制牛奶中單增李斯特菌的生長。

豬肉含水量高,富含蛋白質和多不飽和脂肪酸,易受到微生物污染、易腐敗,從而導致肉類行業的經濟損失[9]。如何保證豬肉的品質和安全性,是目前亟需解決的問題。肉類主要腐敗菌包括假單胞菌、不動桿菌、莫拉氏菌、乳酸桿菌等[10],通常腐敗微生物不會對人體健康造成不利影響,但當其數量達到一定程度時,會造成人體胃腸道紊亂[11]。然而,目前所采用的冷藏手段不能完全保證豬肉的安全性以及滿足消費者的需求[9],所以將防腐劑與冷藏手段相結合是一個可行的方向[12]。

應用于豬肉的防腐劑根據其來源可分為化學防腐劑和生物源防腐劑兩種,目前控制食品微生物的主要措施是添加化學防腐劑,但由于安全性問題,現代食品工業越來越注重生物源防腐劑的使用[13]。目前,微生物源保鮮劑在水產品中的應用已有報道[14],同樣對于動物性食品,其在豬肉中的應用具有一定價值。

嗜酸乳桿菌NX2-6是由內蒙古錫林郭勒地區牧民家庭中以傳統發酵方法制作的酸馬奶中分離得到的,其產的細菌素acidocin NX2-6具有廣譜抗菌活性。劉曉茜等[15]前期研究表明,嗜酸乳桿菌NX2-6產抑菌物質對櫻桃番茄具有良好的保鮮效果。因此,嗜酸乳桿菌NX2-6所產抑菌物質具有作為生物防腐劑應用于冷鮮肉防腐的潛力。本實驗以菌落總數、pH、揮發性鹽基氮、感官評價為鮮度指標,探討嗜酸乳桿菌NX2-6細菌素對冷鮮豬肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

后腿精瘦肉 蘇果超市雨潤集團冷鮮肉專柜;Nisin 浙江銀象生物科技有限公司;所有培養基用試劑 均為國藥-滬試,分析純。

HYG-A全溫搖瓶柜 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司;UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;HGPN型隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;ORION 3-star pH計 美國Thermo公司;Haier SC-350立式冷藏柜 青島海爾特種冰柜有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的效價研究

1.2.1.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的制備 以脫脂乳培養基,由甘油管接種發酵12 h作為種子液,以8%的接種量接入實驗室改良的發酵培養基(蛋白胨20.0 g/L,牛肉浸膏20.0 g/L,酵母浸膏10.0 g/L,K2HPO4·3H2O 3.0 g/L,檸檬酸三鈉6.0 g/L,乙酸鈉8.0 g/L,吐溫-80 3.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO4·H2O 0.076 g/L)中,發酵48 h后,5000 r/min離心30 min,棄沉淀,獲得上清液(發酵上清為嗜酸乳桿菌NX-6細菌素粗品,考慮到使用成本,直接將粗品用于下步實驗,下稱“嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質”)。

1.2.1.2 檢測菌懸液的制備 將檢測菌藤黃微球菌接至斜面,37 ℃培養24 h,再接入100 mL種子培養基(NA),33 ℃,180 r/min,培養8 h,至菌對數生長中后期,取出置于冰箱備用,作為檢測種子液。

1.2.1.3 Nisin標準液的配制 準確稱取8 g Nisin(103IU/mg),溶于100 mL 0.02 mol/L HCl中,配制成8000 IU/mL Nisin標準液備用,需要時用0.02 mol/L HCl稀釋即可。

1.2.1.4 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質效價的測定 利用牛津杯單層瓊脂法:在18 cm平板上放入牛津杯后倒入混有濃度為106～107CFU/mL的指示菌的培養基,待培養基凝固后取出牛津杯,在各孔中加入不同濃度的嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質和不同濃度的Nisin,在37 ℃培養12 h,測定抑菌圈直徑。根據Nisin的標準曲線以及嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的抑菌圈大小計算效價。

1.2.2 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質在豬肉保鮮上的應用

1.2.2.1 豬肉處理 獲取豬肉肉段后,用冰盒運送至實驗室,用無菌水沖洗肉段,于無菌鋼絲網上瀝干,在超凈臺中進行切分(每段約20 g),隨機將豬肉分為如下5組(每組約100 g):

C組:對照組,浸泡蒸餾水30 min作為對照;N組:陽性對照組,浸泡0.5%(質量體積比,以0.02 mol/L的稀鹽酸為溶劑,下同)Nisin溶液30 min;1%S組:低劑量處理組,以1%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;2%S組:中劑量處理組,以2%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;4%S組:高劑量處理組,以4%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min(預實驗表明,2%S組與0.5%N組保鮮效果較為接近,故選擇2%S為中劑量處理組,并設置1%S與4%S為低劑量處理和高劑量處理)。浸泡完成后,以無菌鋼絲網瀝干30 min后,分裝于無菌的均質袋(北京路橋)中,在冰箱(4±1) ℃中存放9 d。樣品在1、3、5、7和9 d分別進行微生物和理化測定。

1.2.2.2 菌落總數測定 根據GB4789.2-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定[12],所有的計數均表示為lg CFU/g。

1.2.2.3 pH的測定 將10 g肉樣品在100 mL蒸餾水中均質,并將混合物過濾,取濾液用電子pH計測定其pH。并設置重復。

1.2.2.4 揮發性鹽基氮的測定 總揮發性鹽基氮利用水蒸氣蒸餾法進行測定。水蒸氣蒸餾法是通過蒸餾加入MgO的均質肉樣品進行。餾出液用含2%硼酸的水溶液進行收集,混合指示劑是用0.1 g甲基紅溶解到100 mL乙醇的溶液。然后,硼酸溶液用0.02 mol/L的鹽酸溶液滴定。TVB-N值(mg/100 g豬肉)取決于鹽酸的消耗量，計算公式如下。

式中:X-試樣中揮發性鹽基氮的含量(mg/100 g);V-測定用樣液消耗鹽酸溶液體積(mL);V′-試劑空白消耗鹽酸溶液體積(mL);c-鹽酸標準溶液實際濃度(mol/L);m-試樣質量(g)。

1.2.2.5 感官評定 豬肉樣品的感官分析是由六個(三男三女)經過培訓的評價者進行。顏色、氣味、質地根據感官評價標準(表1)進行打分,其中1和10分別為最低和最高的質量分數，感官評分為6被認為是可接受的界限。

表1 低溫貯藏條件下豬肉的感官指標評價標準(分)[16]Table 1 Scale for sensory evaluation of meat under the condition of low temperature storage(score)[16]

1.3 數據處理

利用SPSS 19.0中LSD(最小顯著性差異法)對試驗中各組指標的變化進行顯著性分析,p<0.05為顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的效價研究

嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的抑菌圈為(21.54±0.42) mm,根據標準曲線y=0.1918x+0.0267(R2=0.9979)得出嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質的效價為14390.37 IU。

圖1 Nisin效價標準曲線Fig.1 The standard curve of Nisin

2.2 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質在豬肉保鮮上的應用

2.2.1 不同處理對菌落總數的影響 冷鮮豬肉在儲藏過程中,其表面的細菌繁殖會加速肉中蛋白質的分解腐敗,因此菌落總數的變化可以反映豬肉的腐敗程度[17]。試驗表明,Nisin和不同濃度嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液處理均能抑制豬肉中微生物的生長。由圖2可見,在1～9 d的儲藏過程中,對照組菌落總數水平及微生物生長速度始終高于各處理組,4%S組效果最佳,而N組效果與2%S組無明顯差異。到9 d時,所有處理組菌落總數水平均低于N組,由此可見,較Nisin而言,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質作用效果更持久。實驗表明,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質能夠明顯抑制冷鮮豬肉中微生物的生長,4%組具有最佳作用效果,從3 d開始,就可將菌落總數水平控制在對照組的1/10以下。

圖2 菌落總數隨著儲存時間的變化Fig.2 The changes of TAC in the process of storage

2.2.2 不同處理對pH的影響 豬肉在貯藏過程中,由于所含水解酶及微生物的作用,其pH會發生變化。由圖3可知,豬肉的pH在貯藏過程中呈現下降后上升的趨勢。這可能與冷鮮豬肉在貯藏前期糖原酵解產生乳酸導致pH下降有關。到貯藏中后期,豬肉源組織蛋白酶被釋放出來,在加上微生物作用會導致豬肉的蛋白質分解而產生氨及胺類等堿性揮發性物質,從而使pH上升[18]。對照組pH比4%S組提前2 d開始上升,且上升速度較快。Nisin組、1%S組和2%組pH化拐點并沒有延遲,但其上升速度受到了一定的抑制。由此可見,2%S組和4%S組處理能夠很好地延緩豬肉pH的變化。由此可見,嗜酸乳桿菌NX-6抑菌物質能通過抑制豬肉中微生物的生長,減少由微生物導致的蛋白質分解,從而延緩pH的變化。

圖3 pH隨著儲存時間的變化Fig.3 The changes of pH in the process of storage

2.2.3 不同處理對揮發性鹽基氮的影響 揮發性鹽基氮是動物性食品在貯藏過程中,因肌肉中內源酶和細菌共同作用,使得蛋白質分解而產生的氨及胺類等堿性含氮物質,通常可以作為肉類初期腐敗的一個評定標準[19-20]。由圖4可知,貯藏期間,豬肉中揮發性鹽基氮含量呈逐步上升趨勢,其中,對照組在7 d后就已高達28.56 mg/100 g。

圖4 揮發性鹽基氮隨著儲存時間的變化Fig.4 The changes of TVB-N in the process of storage

根據國家標準GB T5009.44-2003肉與肉制品衛生標準[21]的分析方法,豬肉食用標準為TVB-N≤20 mg/100 g,表明對照組豬肉在7 d時就已低于食用標準。而經嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液處理的豬肉中揮發性鹽基氮含量上升趨勢明顯減緩,在9 d時,4% S組達到國標最高檢出限。由此可見,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液能通過抑制豬肉中微生物的生長,有效減少由細菌作用產生的揮發性鹽基氮,4% S組處理效果最佳,可將豬肉的腐敗延遲2 d。

2.2.4 不同處理對感官品質的影響 感官評分可以直觀地反映豬肉在儲存的品質變化。實驗初始,豬肉氣味正常,具有豬肉特有新鮮氣味、紅色與白色肌肉色澤,粘液透明,肌肉致密,彈性恢復良好。隨著貯藏過程的進行,其顏色、質地、氣味三項感官指標的變化均呈明顯下降趨勢。從表2可見,在貯藏過程中,除2%S組在第5 d時顯著降低外(p>0.05),各處理組顏色評分與對照組沒有顯著性差異(p>0.05)。在色澤方面,N組在7～9 d顯著優于其他各組(p<0.05)。第3、7、9 d時,1%S組、2%S組和4%S組氣味評分顯著高于對照組(p<0.05),其中4%S組最優。由此可見,嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液處理有利于減緩豬肉的氣味劣變,但不利于其顏色和質地的保持。

表2 感官指標變化Table 2 The change of sensory evaluation in the process of storage

3 結論

實驗結果表明,冷鮮豬肉經4%嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液浸泡處理30 min后,于4 ℃條件下貯藏9 d,可將豬肉腐敗延緩2 d。從3 d開始,4%S組的菌落總數水平就始終在對照組的1/10以下;pH變化拐點比對照組延遲2 d出現,且變化趨勢明顯緩于對照組;TVB-N值比對照組推遲2 d到達國標最高檢出限;從3 d開始，中高劑量處理組氣味評分始終顯著優于對照組(p<0.05)。由于嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液濃度過高不利于豬肉顏色和質地的保持,故不宜選擇更高濃度進行處理。

與常見生物源保鮮劑Nisin相比,嗜酸乳桿菌NX-6細菌素存在一定優勢,但也有些許不足。經4%嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液處理后的樣品,顏色與質地評分低于Nisin組,其他各項指標均優于Nisin處理組。此外,Nisin在貯藏后期抑菌效果明顯下降,而嗜酸乳桿菌NX-6細菌素則抑菌效果較Nisin更為穩定和持久,在7 d仍能將菌落總數控制在7 lg CFU/g以內。

綜上所述,嗜酸乳桿菌NX-6細菌素在冷鮮豬肉保鮮中具有較大的潛力。在后續研究中,基于對豬肉感官品質的綜合考慮,可以選擇Nisin與本產品進行復配,在保證微生物生長得到抑制的同時,減緩豬肉色澤的劣變,從而取得更好的保鮮效果。