植物單寧的生物活性研究進展

舒 暢,趙韓棟,焦文曉,范新光,姜微波

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

單寧(tannins)是一類高分子量水溶性多酚類化合物的總稱,廣泛分布于植物的葉、根、果實和表皮等不同組織中。其分子量在500～3000 Da之間,一些縮合單寧的高聚體分子量可超過3000 Da[1]。單寧中含有大量羥基,可形成分子間和分子內氫鍵,能夠與大分子化合物如蛋白質、碳水化合物相互作用并沉淀。單寧是水果和蔬菜中澀味的主要物質,分子內羥基數在1～5個范圍內,澀味隨羥基數量增加而增加,但超過7個羥基,由于空間位阻效應(steric hindrance)開始抵消氫鍵的強度,澀味變弱[2]。

單寧可分為水解單寧和縮合單寧兩大類,縮合單寧又稱兒茶素單寧或原花青素。水解單寧由酸及酸的衍生物與葡萄糖或多元醇通過酯鍵形成,易被酸或酶水解為酚酸、糖和多元醇。根據分解產生的酚酸的種類不同,水解單寧又可以分為沒食子單寧(棓單寧)和鞣花酸單寧。沒食子單寧的水解產物為沒食子酸,鞣花單寧的水解產物為六羥基聯苯二酸和鞣花酸。水解單寧生物活性較強,在醫藥、食品、化工等領域應用廣泛[3]。

縮合單寧是植物中含量最豐富的多酚類物質,是一類由黃烷-3-醇單元結構通過4→8或4→6 C-C鍵(也有通過C-O-C鍵)縮合而形成的寡聚物或多聚物[4],也被稱為兒茶素單寧、原花青素、低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidin,OPC)。在熱醇-酸溶液中能酸解生成花色素。黃烷-3-醇及黃烷-3,4-二醇是縮合單寧的前體,經縮合最終形成縮合單寧。在熱酸處理下,黃烷-3-醇不產生花色素,不屬于原花色素,但是原花色素的重要前體。由于縮合單寧的結構單元類型、連接方式、聚合度、空間構型多樣性,目前只準確測定了部分縮合單寧的化學結構。

單寧廣泛分布于水果、蔬菜、堅果等中,主要以膳食多酚的形式被人體攝入,日常飲食中單寧的含量見表1。盡管日常飲食中含有豐富的單寧(每日攝入約0.1～0.5 g),但由于其聚合性質及其高級結構的復雜性,目前對單寧的化學結構及其生物活性的研究仍然較少[5]。

表1 不同食品中單寧的含量Table 1 Tannins content in different foodstuffs

近年來的研究發現原花青素單體具有免疫調節、抗炎、抗癌、抗氧化、保護心血管和抗血栓等多種生物活性[6-8],引起了研究者的廣泛關注。本文綜述了近幾年單寧吸收代謝和生物活性的研究結果,為單寧的生物活性研究、開發利用新型藥物資源等提供更多的理論依據。

1 單寧的吸收和代謝

簡單酚類物質在人體內的吸收、代謝和生物利用率已有相關研究[9],但由于單寧的化學結構復雜,簡單酚類的代謝規律并不完全適用于原花青素,其吸收代謝過程仍存在爭論。Wiese等[10]的研究表明,高分子量的原花青素并不能被完全吸收,蘋果汁中的原花青素有近90%可在回腸中檢出,說明原花青素能夠進入結腸而并未被吸收。單寧的聚合度會影響其通過腸屏障的吸收,也會影響腸道微生物對單寧的分解(分解為兒茶素和表兒茶素)。一些體內和體外實驗研究了聚原花色素的水解機理及其衍生的低聚分子在小腸中的吸收,在血液中能檢測到少量的原花青素單體和二聚體,其主要代謝產物為甲基化和葡糖醛酸化衍生物。在結腸中,原花青素可被腸道微生物分解成一系列簡單代謝物,如苯戊酸酯、苯乙酸和苯丙酸[11]。然而,這些實驗結果及其機理仍然存在爭議。

1.1 體外實驗

體外實驗結果表明,可可原花青素可在模擬人胃環境下水解成表兒茶素單體或二聚體。但有其他研究表明,可可原花青素在胃中并不能完全解聚。這可能由于實驗設計的條件提供的模擬胃酸環境不同,結果也有所不同[12-13]。在消化過程中,小分子的原花青素(如二聚和三聚體)更容易被吸收,高分子量的原花青素可與蛋白質、淀粉和消化酶形成復合物,形成不易消化的復合物,這與單寧的聚合程度有關。低聚原花青素的吸收代謝已有相關綜述報道,原花青素A型的二聚體、三聚體和四聚體可穿過Caco-2細胞單層膜,轉運率分別為0.6%、0.4%和0.2%,這表明飲食攝入的低聚原花青素在體外可被消化細胞吸收。此外,(+)-兒茶素和原花青素二聚體和三聚體的滲透系數相似,而高聚合度的原花青素的轉運率比其低約10倍[11]。Engemann等[14]使用豬盲腸模型模擬腸道微生物群對原花青素A2和肉桂鞣質B1的降解作用,發現約80%的原花青素A2和約40%的肉桂鞣質B1被降解為羥基化的多酚類化合物。水解單寧經幾種細菌酶代謝為沒食子酸、連苯三酚、間苯三酚,最后可代謝為乙酸酯和丁酸酯[15]。

綜上,體外實驗的結果表明膳食攝入的原花色素大多可以經過消化系統,并可能到達結腸部位,通過微生物的分解吸收,產生苯乙酸、苯丙酸和苯丁酸等代謝產物[15]。Déprez[16]利用14C標記檢測代謝產物,發現代謝產物濃度較理論值低。這可能是由于原花色素與腸細胞中各種其他分子以及與結腸腔中的纖維強烈結合所導致。目前關于原花色素代謝菌菌種的研究較少。

1.2 動物實驗

低聚原花青素可在大鼠小腸中被水解成表兒茶素[12]。用荔枝多酚提取物灌胃大鼠,在大鼠血液中可檢測到原花青素原型,尿液中可以檢測到微量原花青素二聚體和三聚體[17]。這些結果表明,只有原花青素的三聚體和二聚體可以在體吸收,這可能是由于其滲透系數與甘露糖醇相似,也可能由于腸內腔對聚合物的生物利用度有限[18]。用柳樹原花青素灌胃大鼠,在尿液中檢測到16種代謝物,主要包括苯乙酸、苯丙酸和苯基丁酸等。其含量隨聚合度的上升而顯著減少:兒茶素單體>二聚體>三聚物>多聚體[19]。

Goodrich等[20]研究了大鼠鼻飼法給予葡萄籽原花青素后的代謝產物,檢測到了14種原花青素單體化合物和24種微生物代謝物。組織學檢測結果顯示,原花青素單體和二聚體在盲腸和結腸中聚集,原花青素在盲腸及其附近區域先出現,大約3 h后達到最大濃度,代謝產物達到最大濃度3～18 h后,出現在其他的末梢區域。Bittner等[21]研究了豬口服給予原花青素B4后的吸收和代謝,結果表明原花青素B4可作為完整分子被吸收,部分由尿液排泄,在體內可被降解為單分子的兒茶素和表兒茶素,然后進一步代謝為甲基化和葡萄糖醛酸化物。

綜上,腸道微生物只能分解原花青素單體和二聚體,隨原花青素的分子量增大,其分解作用降低。因此聚合度較低的原花青素能夠被機體所吸收并發揮其抗氧化活性,聚合度較高的原花青素由于分子量太大而無法被吸收,使其體內抗氧化活性減弱。

2 單寧的生物活性

單寧的生物活性已得到廣泛的關注,國內外已有相關文獻[22-25]報道。單寧可防止多種慢性疾病的發生,目前認為單寧的生物活性主要來源于黃烷-3-醇及其衍生物[24,26-27]。單寧的生物活性降低主要取決于兩方面,一方面是高分子量化合物的生物利用率低,降低了其生物活性;另一方面是單寧與其他物質相結合影響其活性。其結合性質可在胃腸道中產生局部作用(如與蛋白質結合),而其代謝產物(二聚體和三聚體)可被人體吸收,產生全身效應[8-9,18,28-29]。單寧具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗過敏和血管擴張等作用[6,11,24,26-27,32]。單寧的主要生物活性及其作用機理見表2。

表2 單寧生物活性研究進展Table 2 Advances in research on biological activity of tannins

2.1 抗氧化、清除自由基

單寧是良好的自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑,其作用機制主要是其結構中的酚羥基在體內釋放H+,競爭性地與自由基結合,從而保護脂質不被氧化,阻斷自由基鏈式反應。體外實驗還證明,原花青素可以抑制脂質過氧化酶和脂氧合酶活性[51],從而防止脂質的氧化。水解單寧和原花青素的抗氧化活性取決于其化學結構,隨聚合度的增加,抗氧化活性隨之增加[8]。蔓越莓原花青素的抗氧化活性是抗壞血酸的10倍,是α-生育酚的37倍[52],一些體外實驗和動物實驗也證明了相似的結論[6,8,30-31]。

Fushimi[53]比較了青熟和完熟柿(DiospyroskakiThunb.)果肉提取物對大鼠的抗氧化作用,結果表明青熟柿組大鼠血漿中磷脂氫過氧化物(膜脂質過氧化產物)水平顯著低于對照組,而完熟柿組與對照組比較無差異。這主要是由于青柿中較多的可溶性單寧提高了果實的抗氧化活性。另一項研究表明,柿果肉和花生皮中的幾種原花色素型二聚體在小鼠體內均具有較高的抗氧化活性,B型二聚體在水相中有較高的抗氧化能力,而A型和B型二聚體在組織或脂溶性體系中抗氧化能力相近[54]。

Zhou[55]測定了紅景天(RhodiolaroseaL.)中的低聚原花青素對小鼠血清、心臟、肝臟和腦組織中自由基的清除活性。實驗表明這些低聚原花青素可以降低細胞的丙二醛含量,增強SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性。Li等[56]通過證明原花青素可提高總抗氧化能力,提高SOD、GSH、GPx和CAT活性,降低MDA水平,從而減少氧化損傷。

2.2 抗腫瘤活性

原花青素的抗腫瘤活性主要是通過調節抗氧化、抗炎、調節信號分子的表達,以及促進腫瘤細胞的凋亡、阻滯細胞周期等作用。Gollucke[33]的研究表明葡萄籽原花青素通過調控Bax/Bcl-2基因的表達并激活半胱氨酸蛋白酶-3,誘導小鼠皮膚表皮細胞JB6 C141進行p53依賴性凋亡。此外,葡萄籽原花青素能夠抑制人表皮角化細胞中MAPK蛋白(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化并調控NF-κB的表達。葡萄籽原花青素可以抑制前列腺癌激素不敏感細胞DU145和前列腺癌激素敏感細胞LNCaP的生長并抑制其中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達,葡萄籽原花青素能夠通過增強抗組蛋白乙酰轉移酶的活性來調節激素受體介導的轉錄[57],基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)參與腫瘤組織的生長和代謝。Chung等[58]也發現葡萄籽原花青素可以抑制胰腺癌細胞中基質金屬蛋白酶的活性。葡萄籽原花青素可以抑制小鼠乳腺癌4T1細胞、結腸直腸癌HT29細胞、LoVo細胞系的細胞活性、增殖,促進其凋亡[8]。Prasad[23]發現葡萄籽原花青素通過干擾細胞周期進程的正常調節,誘導Cip1/p21和Kip1/p27蛋白水平上升,以及細胞周期蛋白D1、D2 E和細胞周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK4、CDK6,導致細胞生長周期停滯于G0/G1期。

除葡萄籽原花青素外,葡萄和松樹皮等富含原花青素的組織同樣可以有效抑制HT29人結腸直腸癌細胞增殖,誘導細胞凋亡和G2期細胞周期阻滯[33]。體外實驗中,漿果原花青素提取物對人口腔表皮樣癌細胞(KB)、人舌鱗癌細胞(CAL-27)、人乳腺癌細胞系(MCF-7)、人結腸癌HT-29、116細胞和前列腺淋巴結癌細胞(LNCaP)有抗增殖和促進凋亡的作用[6]。

2.3 抗菌性

單寧可抑制胞外酶活性、與微生物生長所需的營養物質相結合(如絡合金屬離子)、使原生質中的蛋白質沉淀變性、破壞細菌外膜通透性或直接作用于微生物代謝影響其生長。此外,單寧還可以干擾微生物細胞壁多肽與巰基反應,使膜蛋白功能喪失[15]。

漿果中的原花青素可以抑制細菌的粘附性,蔓越莓原花青素可以抑制粘附于尿路上皮的大腸桿菌的生長。原花青素的分子結構會影響其抗粘附性,蔓越莓原花青素是由一系列兒茶素寡聚體和A-型連接形成的聚合物,在結構上與葡萄、蘋果等其他來源的原花青素不同,是唯一能夠抑制細菌在人體粘附的原花青素。動物實驗結果也證明蔓越莓原花青素及其代謝物能夠抑制細菌在尿路上皮的粘附[59]。

云莓(RubuschamaemorusL.)、樹莓、草莓多酚提取物含有豐富的鞣花酸單寧,對空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和白色念珠菌(Candidaalbicans)具有很好的抑制效果。覆盆子和藍莓多酚提取物對革蘭氏陽性菌(單胞李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌)和革蘭氏陰性菌(費氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌)都有抑制活性[6],幽門螺桿菌和蠟狀芽孢桿菌對漿果原花青素最敏感,而發酵酵母對其具有抗性[60]。林生假榆桔(PteleopsishylodendronMildbr.)多酚提取物富含鞣花酸單寧,能夠抑制肺炎克雷伯桿菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌活性[15]。石榴皮多酚提取物能抑制金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、單胞李斯特菌和大腸桿菌活性。鞣花酸單寧能夠抑制金黃色葡萄球菌(包括甲氧西林金黃色葡萄球菌)、大腸桿菌、白色念珠菌莢膜的形成[61]。安石榴甙、安石榴林具有抗真菌活性,可以抑制白念珠菌、新型隱球菌、煙曲霉活性[15]。

單寧的抗病毒活性與其化學結構有關,化學性質越活躍，其細胞毒性越強。單寧可以通過與病毒包膜組分相結合從而影響其活性。單寧可干擾單純皰疹病毒(HSV)、艾滋病毒(HIV)對營養物質的吸收及其產生的細胞病變效應[60]。鞣花酸單寧和幾種原花青素還是逆轉錄酶抑制劑[62],可以抑制乙型肝炎病毒感染細胞中E抗原(HBeAg)的分泌[15]。

3 結語

單寧為多酚類化合物,在植物中分布廣泛,具有多種生物活性,能夠清除自由基、抗菌、抑制腫瘤、保護心血管、預防糖尿病。目前對單寧的研究正日趨成熟,其應用也愈加廣泛,但有些方面的研究仍有待提升。首先,生物利用率是單寧在體內產生生物活性的先決條件,單寧在體內的吸收機制、其影響因素尚未完全明確,這對開發和利用單寧類化合物具有重要的意義。此外,單寧的化學結構復雜,分子量大小、結構單元類型、連接方式、聚合度、空間構型等對其生物活性的影響尚不明確,需要大量的實驗數據和總結考證。單寧及其代謝產物產生多種生物活性的機制尚有待進一步研究,建議進一步確定其體內代謝中潛在的活性成分。最后,單寧的細胞毒性及機理尚未明確。因此,對于單寧的研究仍有大量工作需要做。