3D生物打印技術在皮膚科的應用研究進展

沈婷婷 高慧

[摘要]精準醫學是新世紀醫學發展的重要方向，而3D生物打印技術得益于轉化醫學的興起和迅速發展，通過個性化、定制化的生產在臨床實踐中挽救了許多人的生命。3D生物打印技術在醫學領域的廣泛應用已遠遠超出了我們的想象，如今在皮膚科及相關領域也倍受關注。本文將重點闡述3D生物打印技術的原理和其在皮膚血管、干細胞、細胞外基質等方面的演變，以及在皮膚病模型方面的潛在臨床應用，并探討其目前的局限性和未來的研究方向。

[關鍵詞]3D皮膚生物打印；皮膚病學；演變；臨床應用

[中圖分類號]R785 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）06-0155-03

Abstract： Accurate medicine is the important direction of medical development in the new century， and thanks to the rise and rapid development of translational medicine 3D-biological-printing has saved many lives in clinical practice through personalized and customized production.3D-biological-printing technology in the wide range of application in the field of medicine has gone far beyond our imagination， now it has also gained considerable attention in dermatology and other related fields. This article will focus on the principle of 3D-biological-printing，and its technological breakthroughs in skin blood vessels，stem cells and extracellular matrix as well as its potential clinical application in skin-disease-related model. At last， I will discuss its current limitation and research direction in the future.

Key words： 3D skin bio-printing； dermatology； evolution； clinical application

皮膚是人體最大的器官，它覆蓋于人體表面，具有屏障、吸收、感覺、分泌和排泄、體溫調節和免疫等多種功能，對保護體內環境的穩定十分重要。皮膚的這些作用在中毒性表皮松解癥、大面積的慢性皮膚潰瘍、嚴重燒傷以及巨大皮膚腫瘤患者身上顯得尤為重要。一方面，由于自體/異體皮膚移植的來源和應用常常受限；另一方面，目前應用較多的組織工程皮膚又缺乏表皮或者真皮成分的支持，移植后很容易出現感染和瘢痕攣縮等并發癥[1]，并沒有實現真正意義上的恢復皮膚完整功能。因此，積極尋找理想的生物皮膚替代品還在不斷探索中。3D打印技術在制作醫學模型、骨替代品、個性化假肢及假體方面已相當成熟，但是在皮膚科及相關領域的應用還處于起步階段，本文就其在皮膚科的應用現狀綜述如下。

1 3D打印技術的概述

1.1 3D打印技術的概念及分類：3D打印（3D Printing）技術誕生于20世紀80年代，又稱為“增材制造”[2]。其首次被應用于醫學領域可追溯至20世紀90年代，醫生通過3D打印技術將顱骨的CT掃描數據轉化為實物模型[3]，其原理是將計算機三維數字成像技術和多層次連續打印技術相結合，簡單來說就是利用重建的三維數字模型，將其分割成層狀，然后逐層堆積成實體模型。

3D打印在臨床上可以分為生物打印和非生物打印，3D生物打印是在3D打印基礎上以活細胞及其它細胞活性成分作為打印材料，最終實現生物活性組織的打印和制作[4]，兩者最大的區別就是有無細胞的參與。生物打印包括生物支架打印、細胞打印等，非生物打印包括打印醫學模型、口腔種植體、假肢假體等。

1.2 3D生物打印的技術與材料：用于3D生物打印的技術[5]主要包括四種：①激光燒結打印，按照預先設定好的程序，通過計算機的控制對粉末材料進行激光加熱、燒結逐層累積形成所需的模型[6]；②噴墨細胞打印，3D噴印技術是根據電流體動力學原理，使用特定的噴頭，噴印流態材料，直接形成模型器件的技術[7]；③立體平板印刷打印，以液態光敏樹脂為原料，通過紫外光掃描液態光敏樹脂使其固化，層層疊加，形成所需模型；④微擠壓成形打印，其原理是在加熱器內融化熱熔性材料，之后抽成絲狀送進熱熔噴頭，在噴頭內再次被融化。其應用于生物打印的主要缺點是打印出的組織中細胞存活率低。

在打印技術不斷成熟的過程中，打印材料的局限性致使其無法滿足醫療領域的苛刻要求，從而阻礙了3D生物打印技術更廣泛地應用于臨床實踐。為突破打印材料的瓶頸，研究者們開展了許多相關的基礎研究，近年來取得較大突破。不斷有新材料應用于醫學打印，從生物相容性、生物降解性、生物惰性、強度、耐久性和延展性方面考慮，如含有聚氨酯二丙烯酸酯和線性半結晶聚合物的油墨等[8]。細胞的選擇是第二個重要的步驟，很多研究者關注于角質細胞（容易培養培養）和成纖維細胞（多向潛能）[9]。不同打印技術對打印材料有不同要求，一種材料可能只適合其中一種或幾種打印技術[10]。

2 3D皮膚生物打印的演變

一直以來，巨大皮膚腫瘤、嚴重皮膚燒傷等引起的皮膚大面積缺損所致的皮膚移植免疫排斥反應等都是困擾人類的重大醫學問題。鑒于目前3D打印技術的發展水平有限，打印皮膚還局限在對皮膚表層（表皮和真皮，不超過200μm）進行再造，不包括血管組織。3D生物打印人工皮膚還只是處于實驗階段，未真正應用于臨床。

Binder[11]是第一個用豬的傷口模型（背部10cm×10cm的皮膚缺損）在體外打印出皮膚。他們對傷口的皮膚厚度和寬度以及皮膚替代物（包含膠原蛋白、纖維蛋白原、角質細胞以及成纖維細胞）進行激光掃描并且使用噴墨生物打印機精準輸送到要求的空間。2012年，基于激光誘導前向的原理，Koch等[12]使用激光輔助技術進行生物打印，他觀察到基底膜的形成，提示皮膚組織的形成有Cx43（一種縫隙連接）在膜上的表達。2013年，麥克等[13]同樣利用激光輔助技術在小鼠背部完整的傷口上打印成纖維細胞、角質形成細胞和皮質醇的混合物。用Ki67染色技術顯示細胞的增殖，但是缺少角質形成細胞的分化以及皮膚血管的形成。

威克森林大學再生醫學研究院的研究員們研究了一種用噴墨打印技術制造皮膚薄層的方法[14]。制皮之前需要取傷者身上一塊不大于郵票的皮膚組織，分析這塊皮膚的層數分布后，將這塊組織放置在經過消毒的噴墨盒中，研究員進行編程并輸入打印機中，三維打印機將會按照程序參照供體的細胞，利用一種膠體和特殊材料，打印出與舊皮膚組織結構相同的新皮膚組織[15]。

2.1 皮膚生物打印與血管：皮膚內含有豐富血管，皮膚細胞要靠血液的供應才能存活。因此，打印血管是打印皮膚的基礎。在組織工程應用中，血管的形成可以通過組織形成細胞和內皮細胞共同植入來實現，其中后者能形成功能性血管。3D生物打印技術的使用，具有改進經典組織工程方法的潛力，因為它可以允許產生具有高空間控制的內皮細胞分配的支架[16]。皮膚打印中最困難的就是實現多血管，早期企圖利用血管內皮生長因子和角化細胞或支架來克服這一困難，卓有成效，但是在這個領域還需要更多研究。

德國弗朗霍夫激光技術研究所研究人員成功利用丙烯酸酯基的合成聚合物打印出血管，這種材料使得打印血管表面分布許多直徑數百微米的微孔，這有利于血細胞和組織的營養交換。新近有研究人員采用噴墨打印與立體光刻相結合的方法，解決了打印只有20um厚的多孔、多分叉人造血管的關鍵技術[17]。

2.2 皮膚生物打印與細胞外基質：細胞外基質是表皮細胞生長和分化的內環境，如何構建這個內環境來誘導皮膚的生成，是當前國內外研究的熱點[10]。汗腺在哺乳動物中發揮著重要的體溫調節作用，像其他皮膚附屬器一樣，它們起源于表皮祖細胞，然而它們對損傷反應的再生能力低，并且是否可以指定表皮祖細胞分化成汗腺細胞譜系，這在很大程度上仍然是未知的。使用3D生物打印技術來制造功能性體外細胞負載（基于明膠和海藻酸鈉的復合水凝膠）：3D細胞外基質模擬物（3D-ECM），可有效為表皮祖細胞創造限制性生態位，確保單側分化為汗腺細胞。此外，將生物打印的3D-ECM直接遞送到小鼠的燒傷爪中可有助于汗腺功能性恢復，這對于治療深度燒傷或其他傷口至關重要[18]。

2.3 皮膚生物打印與干細胞：干細胞可以分化成內皮細胞促進血管生成，用于皮膚組織工程或者上皮本身促進上皮再生。Skardal[19]使用激光沉積生物打印技術聯合具有分化成血管潛能的干細胞，發現它們極大地促進了傷口損傷后的愈合。骨源間充質干細胞通過促進血管生成、上皮化、造粒和組織形成表現出有效的體內皮膚再生，羊水干細胞由于他們的高增殖能力，更強的血管生成反應和可被忽略的免疫原性被選中。至第7天，這兩種類型的干細胞都消失了，說明皮膚傷口的再生作用可能歸因于干細胞生長因子的釋放以及某些常駐細胞的聚集而不是干細胞分化為角質細胞或成纖維細胞。對于大面積燒傷的患者來說，尋找自體移植細胞是困難的，體外培養單種細胞，皮脂腺和毛囊的生長也受到限制。而干細胞可以自我更新并且分化成多種細胞類型。

3 皮膚病模型的潛在臨床應用

潛在的皮膚病學應用包括用3D生物皮膚來開發和測試新型生物療法，如燒傷、皮膚腫瘤、銀屑病、白癜風等，此類疾病是皮膚科領域研究的熱點和難點。這為備受皮膚病困擾的患者帶來了佳音[4]。許多疾病以及藥物的副作用都通過皮膚癥狀表現出來，3D生物打印等微細加工技術的最新突破使建立用于藥物篩選的更可靠的體外皮膚模型成為可能。對于人體相關的藥物測試通過結合不同的皮膚成分（如附屬器，毛細血管，神經等）可用于皮膚疾病的藥物開發[20]。最近在組織再生和皮膚燒傷治療中具有巨大潛力的突破性技術就是3D打印[21]，通過3D打印對皮膚燒傷或皮膚腫瘤術后導致的大面積皮膚缺損的微循環進行概括，這可能需要研究細胞增殖，轉移和化療藥物測試，相比于2D細胞能更有效地模仿體內反應。Eves等[22]體外培育角質形成細胞、成纖維細胞及黑素瘤細胞，經過3D生物打印生成黑色素瘤皮膚模型，體外研究細胞外基質及鄰近皮膚細胞對皮膚黑素瘤細胞侵襲的影響。Harvey等[23]利用3D生物打印機打印出正常皮膚模型后，首先將其置于氣液界面，7d后加入白細胞介素22（IL-22）共培養14d，即誘導出銀屑病疾病模型，期間通過阿爾瑪藍染色觀察細胞分化及代謝情況。

4 局限性與展望

3D生物打印皮膚仍存在較多缺陷，其韌性及機械性能同正常在體皮膚仍有較大差距，其不具有毛囊、血管、汗腺等皮膚附屬器官，同時缺乏黑色素細胞、朗格罕氏細胞等成分[1]。 在這種新技術的臨床潛力被實現前，血管化、最佳細胞、支架組合和3D生物打印的成本是亟需克服的困難[24]。

用生物兼容的“墨水”打印角質細胞、成纖維細胞和干細胞都是可能的，但是重新獲得皮膚完整的結構和功能使得傷口修復控制溫度覺以及感覺還有待實現。同時尋找低成本高性能的新型生物打印材料將是醫學3D生物打印的發展方向之一。

[參考文獻]

[1]何雪鋒，熊愛兵.3D打印技術在整形外科的研究及應用進展[J].中國組織工程研究，2017，21（3）：428-432.

[2]Wilcox B，Mobbs RJ，Wu AM，et al.Systematic review of 3D printing in spinal surgery： the current state of play [J].J Sping Surg，2017，3（3）： 433-443.

[3]Mankovich NJ， Cheeseman AM， Stoker NG. The display of three-dimensional anatomy with stereolithographic models [J].J Digit Imaging，1990，3（3）：200-203.

[4]孫利，魯嚴.3D生物打印技術在皮膚科的研究進展[J].國際皮膚性病學雜志，2017，43（3）：125-128.

[5]Colaco M，Igel DA，Atala A.The potential of 3D printing in urological research and patient care [J]. Nat Rev Urol，2018，15（4）：213-221.

[6]馬旭東.選擇性激光燒結在3D打印中的應用[J].工程技術研究，2016， 39（7）：71.

[7]孫云.三維噴印成形質量優化研究[J].無線互聯科技，2016，4：129-131.

[8]Kuang X，Chen K，Dunn CK，et al.3D printing of highly stretchable， shape-memory， and self-healing elastomer toward novel 4d printing [J]. Acs Appl Mater Interfaces，2018，10（8）：7381-7388.

[9] Tarassoli SP，Jessop ZM，Al-Sabah A，et al.Skin tissue engineering using 3D bioprinting： an evolving research field[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg， 2018，71（5）：615-623.

[10] 楊道朋，夏旭.3D打印生物材料研究及其臨床應用優勢[J].中國組織工程，2017，21（18）：2927-2933.

[11] Binder KW，Zhao W，Aboushwareb T，et al.In situ bioprinting of the skin for burns[J].J Am Coll Surg，2011，211（3）：s76.

[12] Koch L，Deiwick A，Schlie S，et al. Skin tissue generation by laser cell printing [J].Biotechnol Bioeng，2012，109（7）：1855-1863.

[13] Michael S，Sorg H，Peck C-T，et al. Tissue engineered skin substitutes created by laser-assisted bioprinting form skin-like structures in the dorsal skin fold chamber in mice[J].PLoS One，2013，8（3）：e57741.

[14]Cartié DDR，Dell Anno G，Poulin E，et al[J].3D reinforcement of stiffener-to-skin T-joints by Z-pinning and tufting[J].Engineering Fracture Mechanics，2006，73（16）：2532-2540.

[15]劉鳳珍，劉明信，王運華，等.3D打印技術在醫學領域中的應用研究進展[J].中國材料進展，2016，35（5）：381-385.

[16]Benning L，Gutzweiler L，Trondle K，et al. Assessment of hydrogels for bioprinting of endothelial cells[J].J Biomed Res A，2017，106（4）：935-947.DOI： 10.1002/jbm.a.36291.

[17]朱敏，黃婷，杜曉宇，等.生物材料的3D打印研究進展[J].上海理工大學學報，2017，39（5）：743-789.

[18]Huang S，Yao B， Xie J，et al.3D bioprinted extracellular matrix mimics facilitate directed differentiation of epithelial progenitors for sweat glang regeneration[J].Acta Biomater，2016，32：170-177.

[19]Skardal A，Mack D，Kapetanovic E，et al. Bioptinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wound[J].Stem Cells Transl Med，2012，1（11）：792-780.

[20]Abaci HE，Guo Z，Doucet Y，et al.Next generation human skin constructs as advanced tools for drug development[J].Exp Biol Med（Maywood）， 2017，242（17）：1657-1668.DOI： 10.1177/1535370217712690.

[21]Mofazzal Jahromi MA，Sahandi Zangabad P，Moosavi Basri SM，et al.Nanomedicine and advanced technologies for burns：Preventing infection and facilitating wound healing[J].Adv Drug Deliv Rev，2018，123：33-64.DOI： 10.1016/j.addr.2017.08.001.

[22]Eves P， Katerinaki E， Simpson C， et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cell： investigation of the roll of proteolytic enzymes [J].Clin Exp Metastasis，2003，20（8）：685-700.

[23]Harvey A，Cole LM，Day R，et al.MALDI-MSI for the analysis of a 3D tissue-engineered psoriatic skin model[J].Proteomics，2016，16（11-12）：1718-1725.

[24]El-Serafi AT，El-serafi IT，Elmasry M，et al.Skin regeneration in three dimensions，curren tstatus，challenges and opportunities[J].Differentiation，2017， 96：26-29.

[收稿日期]2018-03-21 [修回日期]2018-05-30

編輯/李陽利