宮頸癌中DNMT1的高表達與其不良生存結(jié)局的相關(guān)性

羅舒 陳非 郭黔 文慶蓮

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科（四川瀘州 646000）

宮頸癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，近三十年，中國宮頸癌發(fā)病率提高了10%～40%［1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)估算，每年全世界的新發(fā)病例有528 000例，死亡約26 000例［2]。輔助放療（放化療）加用鉑類化療可提高單純放療后晚期宮頸癌患者的生存率，但5年相對生存率仍較低［3]。由于宮頸癌影響年輕女性，尤其是在發(fā)展中國家，女性失去生命不僅影響女性，而且影響整個家庭的福祉。要改變這樣的現(xiàn)狀就需要進行新穎的及量身定制的治療方法來改變這種疾病的預(yù)后。

人乳頭瘤病毒的癌蛋白E6/E7可結(jié)合和上調(diào)DNMTs，使得基于DNA甲基化的新型治療對于宮頸癌尤為重要。盡管宮頸癌中DNMTs高表達，且與DNMT1相關(guān)的DNA甲基化在腫瘤進展中起關(guān)鍵作用［4-5]，但是，目前確沒有研究評估DNMTs的表達與宮頸癌生存的相關(guān)性。評估DNMT1的表達程度及其與宮頸癌生存的關(guān)聯(lián)是重要的，這可能提供DNMT抑制劑治療宮頸癌的機會。研究表明DNMT抑制劑能夠通過內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和癌睪丸抗原的去甲基化來上調(diào)上皮癌細胞中的免疫信號。此外，有眾多臨床研究在測試結(jié)合表觀遺傳療法和免疫療法治療某些癌癥的療效，但目前并沒有針對宮頸癌的測試［6]?；诖?，本研究將從表觀遺傳學(xué)入手，探討宮頸癌中DNMT1的高表達與其不良的生存結(jié)局的相關(guān)性，以期為宮頸癌的治療提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012～2016年在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科就診的102例患者，年齡35～72歲，平均（46.18±11.10）歲。其中鱗癌75例，癌旁組織20例作為對照，腺癌30例，癌旁組織10例作為對照，同時各選取同時期因子宮肌瘤切除子宮的正常宮頸組織20例作為對照，所有新鮮組織由手術(shù)或活檢獲取，所有患者術(shù)前均未接受放化療。為了滿足患者數(shù)據(jù)的機密性，研究中使用的所有標(biāo)本都被剝離了標(biāo)識符，整個研究中只使用了編碼標(biāo)識符。

1.2 試劑及方法

1.2.1 DNMT1免疫組化檢測將層厚約4μm的石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，以pH 9.0的EDTA溶液進行抗原修復(fù)，抗原恢復(fù)后，將切片冷卻，在去離子水（dH2O）中漂洗，并在室溫下置于3.5 mol/L HCl中15 min以打開DNA，將切片用dH2O沖洗并用3.0%H2O2處理5 min以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片與預(yù)免疫山羊血清（3%）在室溫下孵育20 min以抑制非特異性染色，然后在室溫下用DNMT1抗體（1∶100濃度）孵育1 h。用Tris緩沖鹽水充分洗滌后，使用多特異性體系（Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA，USA）檢測一抗。根據(jù)制造商的說明書（Biogenex，Inc.，San Ramon，CA，USA），使用3，3-二氨基聯(lián)苯胺底物試劑盒使抗體-抗原復(fù)合物可視化，并用蘇木精輕度復(fù)染色。將切片依次浸入70%，95%和100%乙醇中（每次3 min），然后使其略微干燥。最后，將載玻片浸在二甲苯中3次（每次3 min），之后用蓋玻片保護。

1.2.2 免疫染色評估基于對細胞核中棕色反應(yīng)產(chǎn)物的強度的視覺評估，以兩個觀察者獨立地記錄DNMT1在細胞核中的表達程度，0（無染色）至4+（強染色）。DNMT1的表達程度是陽性的細胞的總百分比乘以適當(dāng)?shù)膹姸鹊梅?。除宮頸癌外，DNMT1陽性細胞百分率取正常上皮基底，下半部和上半部分的強度評分的平均值，以獲得DNMT1平均表達程度。無論宮頸癌組織或正常組織報告的DNMT1表達程度均取兩個觀察者的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Graphpad 6.01軟件中survival table對DNMT1表達與生存率的關(guān)系進行統(tǒng)計分析。通過Kaplan-Meier方法估計存活曲線，并使用Cox的比例風(fēng)險回歸模型進行多變量分析。DNMT1陽性細胞百分比及表達強度的相關(guān)性以Spearman等級采用相關(guān)分析雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達DNMT1表達于細胞質(zhì)和（或）細胞核中，陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。見圖1。

圖1 宮頸癌組織及正常宮頸組織免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of cervical cancer tissues and normal cervical tissues

2.2 癌組織、癌旁組織及正常組織中DNMTI陽性細胞百分比宮頸癌組織中DNMT1陽性細胞百分率顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），同時比較宮頸癌旁組織及正常宮頸組織中DNMT1的陽性細胞百分比，可見癌旁組織顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）。宮頸癌組織中DNMT1細胞陽性百分比顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 癌組織、癌旁組織及正常組織中DNMTI陽性細胞百分比Fig.2 The percentage of DNMTI-positive cells in cancerous，paracancerous and normal tissues

2.3 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1陽性細胞百分比宮頸鱗狀細胞癌中DNMT1陽性細胞百分比顯著高于癌旁組織及正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。宮頸腺細胞癌中DNMT1陽性細胞百分比顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），而與癌旁組織間無明顯差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1陽性細胞百分比Fig.3 The percentage of DNMT1 positive cells in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.4 宮頸腺鱗癌及正常組織中DNMT1強度得分宮頸腺細胞癌AC中DNMT1強度得分顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而與癌旁組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），宮頸鱗狀細胞癌SCC中DNMT1強度得分顯著高于癌旁組織及正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）。見圖4。

圖4 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1強度得分Fig.4 DNMT1 intensity score in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.5 DNMT1不同表達程度生存曲線選取陽性細胞百分比77.5%及評分1.394 6作為標(biāo)準(zhǔn)進行比較，消除人數(shù)所占比帶來的影響。如圖5該標(biāo)志物表達水平低的女性相比，DNMT1陽性細胞百分比高于77.5%，DNMT1評分高于1.394 6的死亡率高4.174倍（P=0.041 1）。

圖5 DNMT1不同表達程度生存曲線Fig.5 DNMT1 survival curves of different degrees of expression

3 討論

在低收入甚至高收入國家均沒有發(fā)現(xiàn)宮頸癌有明顯的下降趨勢［7]。在全球，宮頸鱗癌是主要的組織學(xué)類型，約占宮頸癌的四分之三［8-9]。HPV感染被認定為是宮頸癌的主要致病因子，但鱗癌（87%）比腺癌（62%）的陽性率更高［10]。基于HRHPV陽性率的差異，與宮頸鱗癌相比，腺癌E6/E7的表達程度可能較低。因此與鱗癌相比，腺癌結(jié)合和上調(diào)DNMT1以及DNMT1的表達也可能更低。與正常宮頸組織相比，癌組織中DNMT1的較高表達也可以通過這種現(xiàn)象來解釋，與正常組織相比，癌組織更可能有表達E6/E7的HPV感染。

作為一種常見的表觀遺傳修飾形式，DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。盡管癌細胞甲基化機制缺陷的確切性質(zhì)尚不清楚，但認為與DNMTs的表達有關(guān)，在哺乳動物中DNMTs主要為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B［11]。已經(jīng)證明DNMT1可以高度親和地識別和結(jié)合DNA損傷，例如堿基錯配，尿嘧啶和其他不尋常的DNA構(gòu)象，這些病變被認為存在于人類癌性病變中［12-13]。這也可以用來解釋與正常宮頸相比宮頸癌組織中DNMT1的表達更高。

基于使用表觀遺傳改變作為治療藥物的表觀遺傳學(xué)治療越來越被認為是用于癌癥治療的主流方法。DNA甲基化是一個基因可以脫甲基化的可逆過程，可恢復(fù)到原來的狀態(tài)，由于DNA甲基化的這種可逆性，已經(jīng)研究了DNMTis作為抗癌劑，因為它們能夠恢復(fù)已表達的基因DNMT的活性［14-15]。食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的DNMTis包括分別在2004年和2006年開發(fā)的阿扎胞苷和地西他濱，已被用于治療骨髓增生異常綜合征［17]。多個研究已經(jīng)鑒定了在宮頸癌細胞中DNA甲基化在表觀遺傳學(xué)上失調(diào)的幾種機制的差異。然而目前還沒有研究評估DNMT1在宮頸癌中的表達，導(dǎo)致基于DNMTs治療宮頸癌的表觀遺傳療法尚處于起步階段。一些研究評估了DNMTs在癌組織中的表達，特別是DNMT1，并且報道了肺癌［18]，胰腺癌［19]中的表達水平或其與總體生存期較短的關(guān)聯(lián)。在本研究中，筆者證明在宮頸癌細胞中DNMT1的表達顯著高于正?；蚍前┘毎?，表明DNMTis可能是宮頸癌的有效和靶向治療。筆者觀察到DNMT1的高表達與不良存活率結(jié)果顯著相關(guān)，這進一步確保單獨使用DNMTis或聯(lián)合免疫治療將是一種改善診斷為宮頸癌的女性的存活的新方法。

盡管HPV的致癌基因有上調(diào)DNMT1的能力，如結(jié)腸直腸癌中的腺瘤性息肉病基因（APC）中DNMT1受高危HPV的獨立途徑調(diào)節(jié)［20]，但依舊可能有其他機制存在。這種途徑是否在宮頸癌中起作用是未知的，但是HPV癌蛋白對DNMT1的上調(diào)作用表明DNMT1應(yīng)該被作為宮頸癌治療的靶目標(biāo)。筆者觀察到DNMT1在宮頸鱗癌中的表達高于宮頸腺癌，并且表達越高患者的預(yù)后越差。本研究的優(yōu)點在于筆者詳細的分析了正常宮頸組織、癌組織及癌旁組織中DNMT1的表達及相關(guān)協(xié)變量調(diào)整后的生存結(jié)果。由于缺乏信息，比如患者的體重，是否有其他疾病，治療的周期及劑量，本研究存在一定的不足。另外只研究了DNMT1而不是所有DNMTs使本研究具有一定的局限性，下一步筆者將繼續(xù)研究DNMT1外的DNMTs與宮頸癌的相關(guān)性，以期更深入的了解宮頸癌的預(yù)后與DNMTs的關(guān)系。

綜上所述：宮頸癌組織中DNMT1陽性細胞率及強度得分均顯著高于正常組織及癌旁組織。隨著癌組織中DNMT1陽性細胞百分率的提高及強度的分的增高，宮頸癌的結(jié)局變的更差。