膿毒癥患者血清高遷移率族蛋白B1對調節性T細胞免疫功能的影響

安曙光 覃炳軍 盧廣軒 范彥琦 賈伯康

廣東省東莞市人民醫院ICU（廣東東莞 523000）

膿毒癥是一種由于感染所導致的全身性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），如果不進行及時治療很容易發展為嚴重的膿毒癥和多器官功能綜合征［1-2]。2016年，第45屆美國重癥醫學年會發布了“膿毒癥-3”新定義及相應的臨床診斷標準，將膿毒癥定義為針對感染的宿主反應失調引起的致命性器官功能障礙。有研究人員的研究結果發現，大概有40%的膿毒癥病人最后會發展為膿毒癥性急性腎損傷（septic acute renal injury，SIAKI），其病死率能夠達到70%左右［3-4]。因此進行及早的診斷以及及早的科學干預是緩解膿毒癥以及預后的重點。SIAKI的發病機制比較復雜，具有較大的危害，研究可以早期以及有效可能夠檢測出患者腎損傷的生物學標志物具有十分重要的臨床價值［5-6]。根據最近幾年的研究結果表明，高遷移率族蛋白Bl（high mobility group box-1 protein，HMCBl）屬于一類十分關鍵的晚期炎癥介質，與膿毒癥的病理生理過程具有直接關系，可能是一種有效的干預指標之一，但目前對其與機體免疫功能之間的聯系的研究較少［7-8]。本研究深入研究了膿毒血病人血清HMGBl水平的變化與機體T細胞免疫功能之間的關聯，探索了膿毒血病人免疫功能異常的發病機制。

1 對象和方法

1.1 研究對象和分組觀察組選取2015年1月至2017年5月間在我院ICU科的不同程度的80例膿毒癥患者。80例患者中有37例膿毒癥患者，43例嚴重膿毒癥患者（其中休克患者有11例）。膿毒癥的診斷根據2001年美國危重病醫學會、歐洲危重病醫學會、美國胸科醫師協會以及美國胸科學會外科感染學會聯席會議有關全身性感染定義國際會議所制定的標準。對照組選擇同期其他病區（神經內科、普外科、心內科）的住院患者80例，所有受試者都沒有感染等并發癥出現。按照膿毒癥患者的預后情況，進一步將膿毒癥患者分為死亡組與存活組，其中死亡組23例，采集血標本，存活組57例。

1.2 方法

1.2.1 樣品準備對所有受試者的血樣進行收集，采取含乙二胺四乙酸（EDTA-K2）的無致熱原試管（美國BD公司產品）對靜脈血進行收集，每管5 mL，采用2 500 r/min進行20 min離心，對患者的血漿進行分離。將血細胞與同體積的無菌生理鹽水進行混合，將此血細胞懸液慢慢放置在無菌以及無致熱原的聚蔗糖一泛影葡胺液面上，在18～20℃的條件下進行2 500 r/min的20 min離心，對第二層云霧狀的低密度細胞進行吸取收集，離心洗滌后將紅細胞進行去除。采取單核細胞以及多形核細胞能夠粘附塑料以及毛細玻璃的特點，然后進一步將T淋巴細胞進行分離和純化。

1.2.2 觀察指標（1）血清HMGBl水平的檢測：取患者的血清100μL，采取人HMGBl酶聯免疫吸附試驗（EUSA）試劑盒（日本Shjno-Test公司）進行檢測，完全根據說明書進行操作，分別計算出標準曲線以及回歸方程，將樣品吸光度值代入標準曲線，然后計算出病人的血清HMGBl水平。（2）采取噻唑藍法對T淋巴細胞增殖活性進行檢測：采取包含體積分數為20%胎牛血清的RPMI-1640培養液將細胞濃度調整到2×106/mL，取0.1 mL細胞于96孔培養板進行接種，然后添加100μL植物血凝素對其進行刺激。在37℃、5%的CO2孵箱中反應68 h，將100μL上清進行吸棄，然后再向各孔添加5 mg/mL的MTT 10μL，輕輕混合均勻，在37℃、5%的CO2孵箱中繼續孵育4 h。然后再添加100μL的曲通異丙醇溶液，在37℃、5%的CO2孵箱中反應過夜，測定波長為540 nm的吸光度值（A值）。（3）細胞培養上清中白細胞介素-2（IL-2）含量測定：采用人IL-2 ELISA試劑盒（北京晶美生物公司產品）進行測定；（4）流式細胞儀檢測CD4+/CD8+T細胞比值：將分離好的外周血單個核細胞用磷酸鹽緩沖液調整到1×106/mL，吸取100μL懸液放到人流式管內，再添加CD8-藻紅蛋白（PE）20μL以及CD4-U藻藍素（APC）20μL，在避光的條件下混合均勻，反應15 min后，再添加400μL磷酸鹽緩沖液。采取流式細胞儀進行測定（流式細胞儀和所有熒光標記抗體都購自美國BD公司）。

1.3 統計學方法本研究中數據全部采用SPSS 20.0統計分析軟件（美國IBM公司）進行處理；計量資料采用均數±標準差表示；多組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率（%）表示；多組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05代表差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 受試者一般資料三組患者在年齡、性別、體重及身高上的指標上差異均無統計學意義（均P＞ 0.05），具有可比性，見表1。

2.2 受試者血清高遷移率族蛋白B1表達與膿毒癥嚴重程度的關系對照組外周血淋巴細胞HMGBl表達量為（5.11±1.30）ng/mL，與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者淋巴細胞基因表達HMGBl明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進行比較具有明顯差異，見表2。

2.3 受試者T淋巴細胞增殖反應變化對照組T淋巴細胞增殖的A值為（0.99±0.41），與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者T淋巴細胞增殖明顯受到抑制，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進行比較具有明顯差異，見表3。

表1 三組患者基本資料情況比較Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

表1 三組患者基本資料情況比較Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

分組膿毒癥組嚴重膿毒癥組對照組F（χ2）值P值例數37 43 80--年齡（歲）51.22±8.16 52.35±7.59 52.50±7.14 6.552 0.212性別（男/女，例）21/16 23/20 43/37 3.562 0.351體重（kg）64.51±11.62 66.07±12.88 65.20±14.16 4.521 0.265身高（cm）165.51±6.92 168.31±6.28 166.60±6.35 5.182 0.599

表2 受試者血清HMGBl表達與膿毒癥嚴重程度的關系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

表2 受試者血清HMGBl表達與膿毒癥嚴重程度的關系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴重膿毒癥組對照組F值P值例數37 43 80--HMGBl值（ng/mL）23.15±4.21*25.24±4.33*5.11±1.30 12.10 0.001

表3 受試者T淋巴細胞增殖反應變化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

表3 受試者T淋巴細胞增殖反應變化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴重膿毒癥組對照組F值P值例數37 43 80--T淋巴細胞增殖（A值）0.41±0.27*0.39±0.23*0.99±0.41 15.96 0.001

2.4 受試者T淋巴細胞分泌IL-2變化對照組T淋巴細胞分泌IL-2水平為（19.35±5.41）pg/mL，與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者T淋巴細胞分泌IL-2水平明顯受到抑制，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進行比較具有明顯差異，見表4。

2.5 受試者CD4+/CD8+T細胞比值的變化對照組CD4+/CD8+T細胞比值為（1.39±0.11），與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者T淋巴細胞分泌IL-2水平明顯受到抑制，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進行比較具有明顯差異，見表5。

表4 受試者T淋巴細胞分泌IL-2變化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

表4 受試者T淋巴細胞分泌IL-2變化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴重膿毒癥組對照組F值P值例數37 43 80--T淋巴細胞分泌IL-2水平（pg/mL）10.03±3.37*8.95±3.31*19.35±5.41 15.02 0.002

表5 受試者CD4+/CD8+T細胞比值的變化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

表5 受試者CD4+/CD8+T細胞比值的變化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴重膿毒癥組對照組F值P值例數37 43 80--CD4+/CD8+T細胞比值1.11±0.09*1.02±0.08*1.39±0.11 11.12 0.006

2.6 受試者血清HMGBl基因表達與受試患者預后的關系對膿毒癥患者死亡組及存活組的血清HMGBl基因表達進行比較，結果表明，死亡組患者淋巴細胞HMGBl基因表達明顯高于存活組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 受試者血清HMGBl基因表達與受試患者預后的關系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

表6 受試者血清HMGBl基因表達與受試患者預后的關系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

注：與死亡組比較，*P＜0.05

分組存活組死亡組t值P值37 80--27.51±4.21*40.59±5.47 6.752 0.001例數HMGBl值（ng/mL）

3 討論

近年，很多關于抗炎治療的臨床試驗并沒有取得預期的結果，膿毒癥后并發癥的發病率和病死率依然持續升高［9]。目前研究人員的研究結果表明，作為一種晚期炎癥介質，高遷移率族蛋白B1與膿毒癥的病理生理過程具有直接關系，屬于一種細菌和其毒素致死反應的關鍵晚期細胞因子，其為進一步研究膿毒癥的發病機制與干預方法提供了新的治療靶點［10]。

本研究結果表明，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者淋巴細胞基因表達高遷移率族蛋白B1明顯升高。且隨著膿毒癥嚴重程度的加深，高遷移率族蛋白B1水平也明顯升高，提示高遷移率族蛋白B1水平與膿毒癥患者的嚴重程度具有直接的關系。目前關于膿毒癥患者的高遷移率族蛋白B1合成以及釋放的具體機制還沒有完全明確，推測可能與急性應激狀態下，細菌內毒素移位以及早期細胞因子具有直接關系［11]。膿毒癥病人在6～24 h內，肝、肺及小腸組織的高遷移率族蛋白B1基因表達明顯升高，說明局部組織高遷移率族蛋白B1的產生與內毒素介導的器官功能損傷具有密切的關系密切［12]。通過進一步的研究表明，采取高遷移率族蛋白B1合成抑制劑能夠有效預防膿毒癥的發生發展并能對其發展過程進行阻滯，并在不同程度上明顯改善組織的損傷程度以及緩解動物預后情況。因此，高遷移率族蛋白B1這個“晚期”細胞因子可能與膿毒癥的發生發展病具有直接關系，進行及早的干預，可能有效的幫助膿毒癥的臨床治療，并減少致死率以及并發癥的發生發展［13]。本研究觀察到，與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者T淋巴細胞增殖明顯受到抑制。這表明膿毒癥患者的T細胞免疫功能受到十分嚴重的損傷，對患者的T淋巴細胞免疫功能進行動態檢測，對監測膿毒癥的病情的變化可能存在一定程度上的臨床意義。本研究還表明，與對照組進行比較，膿毒癥組、嚴重膿毒癥組患者T淋巴細胞分泌IL-2水平明顯受到抑制。這表明在膿毒癥患者的外周血T淋巴細胞增殖能力與IL-2產生能力一直處在受抑制的狀態，其中以嚴重的膿毒血患者尤其明顯。研究發現，膿毒癥病人的純化的CD8+T細胞增殖能力高于CD4+T細胞，推測可能與前列腺素刺激CD8+T細胞的生產、降低IL-2的水平以及阻滯T細胞增殖具有一定關系。高遷移率族蛋白Bl作為一種細胞核內非組蛋白，全程參與了膿毒癥患者的病理發展過程，并成為膿毒癥潛在的重要干預靶點之一。然而，高遷移率族蛋白B1與機體免疫功能間的關系尚不清楚［14]。另外，丙酮酸乙酯能夠通過抑制高遷移率族蛋白B1的釋放從而緩解患者淋巴細胞的功能出現紊亂，即能夠明顯提升脾淋巴細胞的增殖能力以及IL-2的產生，從而有效緩解膿毒癥病人的細胞免疫功能障礙。

通過上述的研究結果表明，高遷移率族蛋白B1不僅屬于一類體內關鍵的晚期促炎癥因子，而且還可能與膿毒癥病人的機體T細胞免疫功能紊亂具有一定程度上的關系，但其具體的作用機制還需要進行進一步的研究探討。