二苯乙烯苷對人結腸癌細胞增殖及凋亡的影響

李品玉 劉其禮 張嫄怡 楊堅 鄭恒

肇慶醫學高等專科學校病理學與病理生理學教研室（廣東肇慶 526000）

大腸癌是發生在大腸黏膜上皮的惡性腫瘤，包括結腸癌（colorectal cancer，CRC）與直腸癌（rectal cancer，RC），是全球最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發病率和病死率均居所有惡性腫瘤第5位［1]。雖然針對結直腸癌的治療取得一定進步，但總體預后仍不理想，其主要原因與腫瘤過度增殖和轉移相關。因此，針對結直腸癌增殖與轉移的治療成為近些年來的研究熱點。

四羥基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是從中藥何首中提取的一種水溶性有效成分，其結構與白藜蘆醇相似，僅二位多一個酚羥基并形成了糖苷，均屬于二苯乙烯類［2]。前期針對THSG在結腸癌中的治療作用筆者開展了一定的研究。TGFβ是腫瘤細胞發生上皮間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）最為相關的因子，在腫瘤轉移過程中扮演重要角色［3]。前期筆者發現THSG通過直接抑制PI3K/AKT通路，從而抑制TGFβ誘導的EMT，提示THSG在抑制結腸癌轉移中發揮著潛在的治療作用［4]。當前研究報道白藜蘆醇在人白血病、胃癌、惡性膠質瘤、結腸癌［5-8]等多種腫瘤中能抑制PI3K/AKT/NF-κB通路。而研究證實PI3K/AKT/NF-κB通路對腫瘤細胞增殖與凋亡至關重要。根據結構相似性和前期研究，筆者推測THSG有望通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，從而抑制結腸癌細胞增殖，促進凋亡，發揮其抗癌的藥理學價值。本研究擬針對THSG對結腸癌增殖和凋亡的影響及其作用機制展開探討，為將其開發成為抗癌藥物提供理論和實驗依據，以期為結腸癌的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株人結腸癌細胞株HCT116和SW480由南方醫科大學病理實驗室提供。

1.2 實驗試劑胎牛血清、RPMI-1640為美國GIBICO公司產品，CCK8試劑購于北京全式金生物技術有限公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司，二苯乙烯苷（純度＞98%）購于成都百科通生物，順鉑購自sigma公司，PTEN及P-AKT、AKT抗體購于Cell Signaling Technology公司，GAPDH和鼠、兔二抗均購于北京中杉金橋有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCK8檢測細胞增殖取對數生長期的HCT116和SW480細胞調整濃度為2×105/mL，每孔100μL接種于96孔板，24 h后吸去培基，分別加入5、10、20 mmol的THSG培養24、48、72 h，隨后每孔加入100μL；含CCK8試劑的培養基（培養基：CCK8=9∶1）37℃培養1 h，酶標儀于490 nm處檢測各孔吸光值（A）。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔A值/對照孔A值）×100%。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡操作步驟按說明書進行。HCT116和SW480在不同濃度THSG作用24 h后，PBS洗滌2次，不含EDTA胰酶消化后加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻后再加入5μL PI混勻，室溫避光15 min，上機檢測。

1.3.3 Western blot將處于對數生長期的HCT 116和SW480細胞分別按70%～80%的密度接種于6孔板中，貼壁后加入不同濃度的THSG作用24 h后收細胞集細胞，加入RIP裂解液裂解1 h后BCA法測定蛋白濃度，加入相應體積的loading buffer 95℃變性5 min。蛋白用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕法轉印至PVDF膜上，轉膜結束后加入相應一抗4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫1 h后常規顯色發光。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，進行多組間的均數比較采用單因素方差分析，分析前先通過Levene法檢測方差齊性，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett′s T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THSG對HCT116和SW480細胞增殖的影響CCK8細胞增殖實驗結果顯示，THSG對結直腸癌細胞HCT116和SW480增殖的抑制呈時間和劑量依賴性。當THSG濃度為5 mmol時，作用于HCT116細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為8.2%、15.133%及22.767%；作用于SW480細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為5.867%、11.100%及14.733%。當THSG濃度為10 mmol時，作用于HCT116細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為23.800%、34.633%及50.967%；作用于SW480細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為12.033%、23.200%及44.300%。當THSG濃度為20 mmol時，作用于HCT116細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為48.633%、6.667%及85.500%；作用于SW480細胞24、48和72 h細胞抑制率分別為40.100%、58.000%及85.333%。見圖1。

圖1 THSG對HCT116和SW480細胞增殖的影響Fig.1 The effect of THSGon HCT116 and SW480 cells proliferation

2.2 二苯乙烯苷對順鉑化療增敏的影響CCK8結果顯示，與單純使用順鉑相比，不同濃度的順鉑與10 mmol THSG聯合作用24 h對HCT116和SW480細胞增殖抑制作用更強。當順鉑濃度為2.5μg/mL時，HCT116和SW480細胞24 h細胞抑制率分別為41.98%和36.31%，與THSG聯合使用后HCT116和SW480細胞24 h抑制率分別為55.48%和57.14%，與單獨使用順鉑相比差異有統計學意義（t=-6.943，P＜ 0.05；t=-7.199，P＜0.05）；當順鉑濃度為5μg/mL時，HCT116和SW480細胞24 h細胞抑制率分別為67.63%和58.26%，與THSG聯合使用后HCT116和SW480細胞24 h抑制率分別為77.33%和82.00%，與單獨使用順鉑相比差異有統計學意義（t=-7.147，P＜0.05；t=-11.726，P＜0.05）；當順鉑濃度為10μg/mL時，HCT116和SW480細胞24 h細胞抑制率分別為86.01%和79.34%，與THSG聯合使用后HCT116和SW480細胞24 h抑制率分別為93.03%和91.70%，與單獨使用順鉑相比差異有統計學意義（t=-3.880，P＜0.05；t=-14.573，P＜ 0.05），見圖2。

圖2 THSG與順鉑聯合使用對HCT116和SW480細胞增殖的影響Fig.2 The effect of combination treatment of THSGand cisplation on HCT116 and SW480 cells proliferation

2.3 二苯乙烯苷對CRC細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，5 mmol THSG作用于HCT116和SW480細胞時，細胞早期凋亡率分別為（6.33±0.45）%和（4.63±0.25）%，10 mmol THSG作用于HCT116和SW480細胞時，細胞早期凋亡率分別為（11.8±0.56）%和（10.53±0.71）%，20 mmol THSG作用于HCT116和SW480細胞時，細胞早期凋亡率分別為（38.87±2.32）%和（40.47±1.06）%。多重結果比較表明，THSG可誘導HCT116和SW480細胞凋亡，且隨THSG濃度的增加，HCT116和SW480細胞早期凋亡率也隨之增加（F=562.515，P＜0.001；F=2241.404，P＜ 0.001），見圖3。

2.4 二苯乙烯苷對PI3K/AKT/NF-κB通路的影響Western blot結果顯示，與空白對照組相比，THSG處理組PTEN的蛋白表達隨濃度的增加呈現遞增趨勢，而p-AKT、p-IKKβ的表達隨濃度的增加呈遞減趨勢，提示THSG可以抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，見圖4。

圖3 Annexin V/PI雙標法檢測不同濃度THSG作用24 h對HCT116和SW480細胞凋亡的影響Fig.3 The effect of different concentration treatment of THSGon HCT116 and SW480 cells apotosis for 24 h was detected by Annexin V/PIflow cytometry

圖4 THSG對HCT116和SW480細胞PI3K/AKT/NF-κB通路的影響Fig.4 The effct of THSGon PI3K/AKT/NF-κBpathway in HCT116 and SW480 cells

3 討論

近年來，隨著國民生活水平的提高，膳食結構和生活方式的改變，結直腸癌的發病率逐年上升，名列各大惡性腫瘤第5位［1]。針對早期腫瘤，手術切除是首選治療策略，而晚期腫瘤則依賴放化療、分子靶向治療等綜合治療［9]。由于缺乏常規體檢篩查，有近一半以上的患者確診時已處于晚期［10]。因此，尋找和開發新的綜合治療策略，具有重大的臨床意義。

中醫是我國的國粹，中醫藥及其提取物在抗腫瘤治療上越來越受矚目。研究證實多種中藥單體如青蒿烯［11]、姜黃素［12]、雷公藤甲素［13]等通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制腫瘤相關信號通路等機制發揮抗腫瘤效果。四羥基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是中藥何首烏提取物之一，與白藜蘆醇存在結構相似性［2]。而白藜蘆醇已被證實通過抗氧化作用和干擾腫瘤相關信號傳導如PI3K/AKT通路、NF-κB通通、mTOR通路、MAPK通路、Hedgehog（Hh）通路等發揮重要的抗癌抑癌的作用［5-8，14]。基于結構相似性，筆者推測THSG可能也發揮著潛在抗癌價值。在前期研究中，筆者也證實THSG通過抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ誘導的結腸癌細胞EMT，從而抑制結腸癌轉移［4]。回顧THSG相關研究，LIU等［15]報道THSG的酚羥基通過給出氫原子，自身形成二聚體，從而清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基，進而發揮抗氧化作用。小鼠心肌細胞中，THSG則拮抗阿霉素誘導的丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的產生，改善化療藥物的心臟毒性［16]。心腦血管方面，THSG抑制炎性因子如CRP、IL-6、TNFα等產生，進而改善動脈粥樣硬化［17]。在其他腫瘤領域，THSG也被證實發揮抗腫瘤功能。乳腺癌中，THSG抑制MCF-7細胞PI3K/AKT通路，從而抑制細胞增殖［18]；黑色素瘤B16細胞中，THSG則抑制MAPK通路，抑制細胞增殖［19]。結合THSG分子結構分析、前期相關研究基礎和國內外文獻報道，筆者有理由相信THSG在結腸癌治療中發揮著潛在抗癌作用，本研究擬探究THSG在結腸癌中的生物學功能及其相關分子機制，為將來臨床應用提供理論支持和實驗依據。

通過對結直腸癌細胞HCT116和SW480給予THSG處理，腫瘤細胞呈現增殖抑制，并呈現濃度和時間依賴性，該研究結果與乳腺癌［18]和黑色素瘤［19]中的研究報道相符，進一步證實THSG的抗癌作用。有研究報道白藜蘆醇在膀胱癌中可增加順鉑化療敏感性［20]，基于結構相似性，本研究接下來探索THSG是否能增加結直腸癌細胞順鉑化療的敏感性。通過CCK-8和流式細胞儀技術，本研究均證實較單用順鉑化療組，THSG聯合順鉑組的細胞抑制率更高，化療誘導的細胞凋亡率也明顯增加，該實驗結果首次說明THSG不但抑制結直腸癌細胞HCT116和SW480的增殖，而且可增加順鉑化療敏感性，是一種良好的化療輔助藥物，具有較大的臨床治療價值，但THSG介導增殖抑制和化療敏感性的潛在分子機制仍不清楚。白藜蘆醇在多種惡性腫瘤中可通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制從而抑制癌細胞增殖，發揮其抗癌作用，同時，研究發現乳腺癌中THSG可抑制PI3K/AKT通路［18]，前期研究筆者進一步確認了THSG在腸癌中針對PI3K/AKT通路的抑制作用［4]。文獻報道THSG在結腸癌HT-29細胞中通過抑制NF-κB通路來抑制腫瘤轉移［21]，而NF-κB通路是PI3K/AKT通路的下游之一。PI3K/AKT/NF-κB通路是經典的腫瘤相關信號通路，PTEN的缺失導致PI3K/AKT通路的活化，磷酸化的AKT促進IKKα和IKKβ磷酸化，激活NF-κB入核，參與調控細胞增殖、EMT、腫瘤發展、化療耐藥等多個生物學功能［22]。因此筆者推測THSG可能在結直腸癌中通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號軸，發揮抑癌功能。Western blot發現隨著THSG刺激濃度的增加，HCT116和SW480細胞中PTEN的水平逐漸升高，AKT的蛋白磷酸化水平則遞減，同時IKKβ的磷酸化水平也受到抑制，說明THSG抑制了結直腸癌細胞中的PI3K/AKT/NF-κB信號通路。

綜上，本研究首次探討了何首烏提取物THSG對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，本研究首次證實THSG抑制結直腸癌細胞的增殖，且增加順鉑的化療敏感性，其潛在的分子機制可能與其誘導PTEN蛋白的表達，抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關。筆者的研究為將來應用THSG抗腫瘤和輔助化療用藥提供了有力的理論和實驗依據。本研究除了以上發現，仍存在不足的地方。雖然多種腫瘤中均證實了THSG的抗癌效果，本研究也在腸癌中針對腫瘤增殖和轉移開展了一系列相關研究并取得了一定的陽性結果，但目前THSG作用的直接藥理學靶點仍未被發現，THSG的抗癌作用也缺乏體內實驗的進一步驗證，其調控的其他腫瘤相關信號通路如MAPK、mTOR Hedgehog（Hh）等也缺乏進一步論證。后續工作中，筆者將綜合高通量手段，篩選THSG相關的作用靶點，構建THSG抗癌分子網絡，明確THSG的確切分子機制，為其將來的臨床應用提供可靠依據。