5-氮雜胞苷對肺癌細胞株功能影響及其機制

許銀輝 賴麒 張小影 陳強 唐亮 劉棟 杜振宗

桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院胸心外科（廣西桂林 541199）

DNA甲基化是表觀遺傳學的核心組成部分，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）是細胞生長過程中的重要組成酶之一，與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)［1]。5-氮雜胞（5-Aza-dC）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，在口腔癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等［2-4]的表觀治療中可使p16、MGMT和PTEN等抑癌基因高甲基化逆轉(zhuǎn)而得以正常表達。RASSFA基因在正常肺細胞中有表達，在肺癌細胞株中存在高甲基化率，將該基因去甲基化的A549細胞株接種于裸鼠后其腫瘤生長明顯縮小［5]；APC基因蛋白調(diào)節(jié)β-catenin蛋白胞質(zhì)內(nèi)降解，是Wnt信號通路的組成部分，其失活后能激活cmyc、CyclinD1等成瘤基因［6]。然而，有關(guān)5-Aza-dC治療后，DNMT1、RASSF1A和APC基因甲基化在肺癌細胞株中的改變情況報道尚少。基于此，本研究選取臨床標本驗證DNMT1在體內(nèi)的表達，并運用非小細胞肺癌細胞株A549、H358和正常肺上皮細胞株BEAS-2B，通過5-氮雜胞處理后，觀察其生長、侵襲和凋亡的變化，檢測RASSFA、APC和DNMT1基因的轉(zhuǎn)錄和表達，來進一步探討3種基因改變特點。

1 材料與方法

1.1 材料細胞株A549、H358、BEAS-2B購于南京科佰生物科技有限公司（上海）；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、10%胎牛血清購于美國強生公司，Hoechst 33342、5-氮雜胞苷采自美國Sigma-Aldrich公司；抗DNMT1、RASSFA，、APC和GAPDH抗體購買于賽信通（上海）生物試劑有限公司；AmpliTaq Gold?購自北京泰澤瑞達科技有限公司；TBST、PBS試劑購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購買于康寧（中國）有限公司；熒光顯微鏡（奧林巴斯IX71，日本奧林巴斯公司）；流式細胞儀購買于美國BD公司；RT-PCR試劑盒購買于北京嘉美紐諾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)3種細胞株先經(jīng)復蘇，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的無菌瓶中，后放置于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液及加藥1次，處理生長至80%時的細胞以0.1%的胰蛋白酶消化，收集對數(shù)期的細胞繼續(xù)傳代或提取蛋白。

1.2.2 赫斯特染色熒光顯微鏡觀察A549和H358細胞系用5-氮雜胞苷處理后培養(yǎng)在37℃的培養(yǎng)箱中24和48 h，后用0.1μg/mL Hoechst 33342（激發(fā)波長365 nm）加到細胞培養(yǎng)基中，染色DNA后室溫放置3～5 min，吸去染液，用TBST和PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。細胞發(fā)生凋亡時，熒光顯微鏡檢測會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的變化。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡處理后的細胞株A549和H358用PBS緩沖液收集和懸浮，通過抗溴脫氧尿嘧啶核苷的單克隆抗體對DNA進行染色。離心收集細胞，棄上清，用PBS洗細胞兩次，加入預冷的70%乙醇，于4℃固定過夜，細胞染色：離心收集細胞，用1 mL PBS洗細胞一次，加入500μL PBS重懸，4℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞株凋亡率，結(jié)果用軟件Modfit分析。

1.2.4 Transwell方法檢測細胞遷移能力 用8 μmol/L孔徑的transwell小室檢測A539和H358細胞的遷移能力：在transwell下層小室中加入500 μL含10%的DMEM培養(yǎng)基作為趨化劑，然后向上室加入200μL含6×104細胞于1%FBS的1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)24 h后用棉簽擦拭去除transwell上層小室尚未遷移的細胞。將小室下層中的細胞用結(jié)晶紫固定并于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞。隨機取4個不同鏡下視野計數(shù)細胞，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測DNMT1蛋白的表達上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，當A549、H358和BEAS-2B細胞貼壁生長到匯合率達80%，選擇生長形態(tài)好貼壁牢固的細胞進行傳代，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)；3 d傳代1次，最終收集細胞。用蛋白裂解液提取蛋白上清液后，分別收集各組蛋白，以BCA法蛋白定量，獲取所得25μg蛋白與5×蛋白上樣緩沖液按照體積4∶1混合，煮沸8 min致變性，后SDS-PAGE電泳，利用PVDF膜濕轉(zhuǎn)250 mA、120 min，密閉1 h，TBST洗膜，加入DNMT1抗體，溫度設(shè)置4℃靜置過夜，后用二抗常溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL熒光顯色后暗室曝光洗片，用Lab Works軟件進行灰度分析，記錄結(jié)果。

1.2.6 RT-PCR檢測DNMT1、RASSFA和APC基因轉(zhuǎn)錄的mRNAA549、H358和BEAS-2B分別用5-氮雜胞苷（3μmol/L）處理24和48 h，收集前后的各組細胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，后進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系：5×reaction buffer 4 μL（Mg2＋10 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）2 μL、Oligo dT 1 μL、RNAse Inhibitor 1 μL、DTT（0.1 mol/L）2μL、總RNA 3μL和M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1μL，DEPCtreated water 6μL；混勻后37℃水浴60 min，然后72℃水浴15 min，4℃暫存10 min，合成的cDNA存放-20℃冰箱備用。RT-PCR反應體系（25 μL）：2×SYBR Premix ExTaq TM 12.5μL，四基因（GAPDH為內(nèi)參照）上、下游引物（10 pmol/L）各1 μL、cDNA 1μL和ddH2O 6.5μL，反應條件為95℃變性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，共32個循環(huán)。取3次實驗均值。采用2-ΔΔCT法分析RASSFA、APC和DNMT1基因mRNA在細胞中的表達情況，引物序列見表1。非小細胞肺癌和非癌組織RNA的提取遵循無酶原則，分別取約80 mg癌和非癌組織，加入Trizol液勻漿，加入0.2 mL的氯仿分離，離心后取上層水相，后加入預冷75%無酶乙醇洗脫，再溶解提純，行RT-PCR檢測DNMT1的mRNA的量。

1.2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件用于統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007登記。數(shù)據(jù)結(jié)果采用非配對t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗去比較兩組數(shù)據(jù)，多組比較用單向方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，實驗至少重復3次。

表1 引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 5-氮胞苷處理后，A549、H358細胞株的生長、侵襲和凋亡通過直方圖，A549和H358表觀治療24和48 h后細胞增殖能力下降明顯，隨著時間延長，細胞阻滯數(shù)目越多（圖1A）；赫斯特染色實驗組的兩細胞株胞漿濃縮，染色質(zhì)固縮，細胞數(shù)目減少，凋亡增加；Transwell方法發(fā)現(xiàn)A549和H358細胞株進入下室的細胞數(shù)目隨著時間減少（圖1B、1C），結(jié)果表明5-氮雜胞苷是能夠有效地抑制肺癌A549和H358細胞株的生長、侵襲和凋亡，隨著時延長，抑制作用越明顯。

圖1 A549、H358細胞株的生長、侵襲和凋亡情況Fig.1 Growth、invasion and apoptosis of A549 and H358 cell lines

2.2 臨床標本和細胞株相關(guān)基因的表達收集桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院確診為非小細胞肺癌的20例標本行RT-PCR分析，DNMT1在非小細胞肺癌中比相應的非癌組織中mRNA轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)（圖2A）；在A549、H358和BEAS-2B細胞株中，DNMT1在mRNA和蛋白水平均有較高的表達，并且A549的表達量（3.54±0.46）要比H358（3.02±0.20）高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖2B、2C）；經(jīng)過5-氮雜胞苷處理24和48 h后的A549、H358細胞株中DNMT1的表達能夠明顯被削弱，RASSFA和APC基因表達量在A549和H358中作用24和48 h分別為（1.002 ± 0.080）、（2.226 ± 0.132），（1.002 ±0.073）、（2.491 ± 0.063）和（1.000 ± 0.035）、（2.12 ±0.039），（1.001 ± 0.67）、（2.124 ± 0.086）。RASSFA和APC基因在兩細胞株中能夠隨著時間延長而表達增加，統(tǒng)計學分析RASSFA基因在A549細胞株中表達較高，APC基因在H358細胞株中表達較高，A549蛋白表達較H358表達高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（圖2D、2E、2F）。結(jié)果表明DNMT1抑制劑5-氮雜胞苷能夠抑制DNMT1基因而使腫瘤抑制基因RASSFA和APC重新表達，與細胞功能試驗結(jié)果吻合，印證5-氮雜胞苷抑制細胞功能過程中，有RASSFA、APC基因上調(diào)和DNMT1基因下調(diào)有關(guān)。

圖2 DNMT1、RASSFA、APC基因轉(zhuǎn)錄和表達情況Fig.2 Transcription and expression of DNMT1，RASSFA and APCGenes

3 討論

DNMT1甲基化轉(zhuǎn)移酶定位于染色體19p13.3-p13.2，擁有1 620個氨基酸，其cDNA全長5 434個堿基對，是哺乳動物細胞中含量最多的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，其在腫瘤細胞中活性較其他轉(zhuǎn)移酶高。文獻［7-8]表明，DNMT1在胃癌、胰腺癌、口腔癌、卵巢癌和喉癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，表達增加的DNMT1作用于抑癌基因的CpG島使其DNA甲基化異常增加，使得抑癌基因得不到正常表達，從而促使腫瘤細胞增殖。抑癌基因甲基化程度從正常肺組織到癌前病變再到肺癌呈明顯增加的趨勢，某些基因的高甲基化可能使腫瘤細胞具有易于轉(zhuǎn)移的潛能。ZHANG等［9]進行的一項針對肺癌患者20個抑癌基因甲基化狀態(tài)的研究結(jié)果顯示，APC、RASSFA、SFRP1、RARβ和P16基因在癌組織中明顯高甲基化，甲基化的程度與病情的發(fā)展、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究采取臨床標本行RT-PCR結(jié)果表明DNMT1在肺癌組織中與其他腫瘤研究一樣呈現(xiàn)高表達；DNMT1基因轉(zhuǎn)錄蛋白在肺癌A549和H358細胞株的表達明顯高于正常上皮細胞的表達，表明DNMT1是促癌基因，甲基化程度較低。給予甲基化抑制劑5-氮雜胞苷后，RASSFA和APC基因蛋白表達明顯增加，與時間呈正比，導致兩肺癌細胞株細胞功能降低。這預示著5-氮雜胞苷能使抑癌基因啟動子區(qū)域出現(xiàn)去甲基化，恢復抑癌基因的正常表達，啟動腫瘤細胞的自殺負調(diào)控機制。因此，去除腫瘤抑制基因的高甲基化狀態(tài)，有利于恢復腫瘤抑癌基因。

DNMT1抑制劑5-氮雜胞苷能夠通過使腫瘤抑制基因去甲基化而抑制癌基因翻譯和轉(zhuǎn)錄，從而阻止腫瘤生長和侵襲。在兩組細胞株A549和H838中，劉邦卿等［10]研究得出通過5-氮雜胞處理后，DNMT1基因的mRNA和蛋白表達水平明顯下降，但其變化是否對相關(guān)抑癌基因甲基化改變和表達無進一步研究。本研究結(jié)果表明A549和H358中DNMT1活性降低，RASSFA和APC基因能夠重新表達，并且A549中RASSFA較明顯，H358中APC較明顯，同時A549的表達量要比H358高，該研究彌補了其實驗無深入研究的不足。因此，DNMT1可以作為非小細胞肺癌表觀治療的預后標記物。綦曉艷等［11]研究得出5-氮雜胞苷可以逆轉(zhuǎn)DR4基因甲基化狀態(tài)，促使肺癌細胞的凋亡，我們實驗表明5-氮胞苷沉默DNMT1后也能抑制細胞生長，誘導A549和H358細胞凋亡，或許與5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)RASSFA和APC基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)有關(guān)。不過，目前有關(guān)5-氮雜胞苷在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的機制尚不完全明確，本實驗結(jié)果表明其能夠使A549和H358生長及侵襲力減弱，并促進凋亡。

綜上所述，肺癌組織中DNMT1基因高表達，表觀治療可使肺癌A549和H358細胞株中DNMT1基因表達降低，在前人基礎(chǔ)上得出抑癌基因RASSFA和APC表達升高，導致癌細胞功能下降，可能預示5-氮雜胞苷能夠誘導RASSFA和APC啟動子區(qū)域去甲基化，從而抑制肺癌腫瘤細胞的增殖、生長和侵襲。不過，5-氮雜胞苷抑制腫瘤細胞的機制能否引起癌基因甲基化增加，仍需進一步研究。另外，本研究只是進行了體外實驗，缺乏體內(nèi)實驗的有力支持，下一步值得探討5-氮雜胞苷對肺癌動物模型的作用效果，以及5-氮雜胞苷聯(lián)合其他抗腫瘤藥物治療的有效性。