高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米中黃曲霉毒素B1方法分析

◎ 陳強勝

（懷寧縣市場監督管理局稽查大隊，安徽 懷寧 246100）

黃曲霉毒素B1是黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的二次代謝產物，毒性強，分布范圍廣，在很多食品中普遍存在，對人類健康的危害性極大。采用高效液相色譜-柱后衍生法對黃曲霉毒素B1有很好的檢測效果。高效液相色譜法是近年來發展起來的一種檢測方法，其原理是在高效液相色譜儀上添加柱后衍生系統分離，再用熒光檢測器測定。與其配套的柱后衍生系統有碘衍生化法、溴衍生化法及較為先進的電化學衍生化法和光化學衍生化法。當前，該方法大多用免疫親和柱來凈化、分離，其凈化效果優異。

本文主要采用高效液相色譜-柱后衍生法檢測大米樣品中的黃曲霉毒素B1，用乙腈-水溶液的混合溶液提取，提取液經免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經液相色譜分離，柱后（碘試劑衍生），經熒光檢測器檢測，外標法定量。

1 試劑和材料

甲醇（CH3OH），色譜純；乙腈（CH3CN），色譜純；氯化鈉（NaCI）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）；氯化鉀（KCI）；鹽酸（HCI）；TritonX-100；碘衍生使用試劑，碘（I2）；AFT B1標準品（C17H12O6，CAS號：1162-65-8），純度≥98%，經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

2 儀器

高效液相色譜儀，日本島津LC-20A，配有柱后衍生系統和熒光檢測器。

3 測定條件

流動相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）。低壓梯度洗脫條件：A，55%；B，45%。色譜柱，C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速，1.0 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣量，40 μL；衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速，0.2 mL/min；衍生反應管溫度，70 ℃；激發波長，360 nm；發射波長，440 nm[1]。

4 分析步驟

按照國標GB 5009.22-2016方法和黃曲霉毒素B1免疫親和柱說明書處理大米樣品。①樣品提取，稱取5 g（m）樣品于50 mL離心管中，加入20.0 mL（V1）乙腈-水溶液，渦旋、混勻、離心后取上清液備用。②凈化，移取40 mL（V2）上清液，按照凈化操作步驟凈化，收集全部凈化液。要特別注意凈化柱需要回至室溫（25 ℃左右）樣品經過親和柱時要嚴格控制流速（1～2滴/s），以使其充分反應吸附。③洗脫，取2 mL（V3）甲醇洗脫凈化柱，要嚴格控制洗脫速度（1～2 mL/min），再用真空泵抽干凈化柱并收集全部洗脫液。④上樣測定，經色譜柱分離進入碘衍生系統。由熒光檢測器檢測[2]。

5 測定譜圖

用已知濃度的AFT B1標準品（C17H12O6，CAS號：1162-65-8）稀釋得到5個不同濃度梯度的AFT B1標準液作為標準品，將步驟4處理得到的分離提取液作為未知樣品。然后一并放入日本島津LC-20A（配有柱后衍生系統和熒光檢測器）的高效液相色譜儀中，并按照步驟3的測定條件進行測定。得到了很好的分離效果，譜圖峰沒有出現分叉、變形、拖尾現象，重現性好[3]。標準品譜圖（由于篇幅有限只列出其中一個標準品的譜圖）和樣品譜圖，分別如圖1、2所示。

圖1 標準品譜圖

圖2 樣品譜圖

6 結果計算

用5個不同濃度的標準品濃度和響應值繪制標準曲線，用此標準曲線加載樣品譜圖得到樣品濃度ρ=2.012 μg/kg。結合步驟4中樣品處理的質量和體積，代入公式（1）計算。

計算結果約為0.4 μg/kg

7 回收率試驗

將已知不含黃曲霉毒素B1的4份大米樣品中分別添加濃度為2.7、5.0、8.0、10.0 μg/kg 4個水平的黃曲霉毒素B1標準品，然后按照上述步驟和方法處理測定。得出平均回收率為88.95%

表1 添加回收率試驗表

8 總結

柱后碘衍生法檢出限為0.1 μg/kg。流動相在國標中給定的比例為A相68%、B相32%，但在實驗中發現按照這種比例本實驗室的液相色譜儀不能很好地分離標準物質，通過不斷調整發現A相55%、B相45%能夠取得很好的分離效果[4]。在該方法檢測過程中免疫親和柱的凈化提取尤為重要，使用前親和柱需要回至室溫（25 ℃左右），樣品經過親和柱時候要嚴格控制流速以使其充分反應吸附，洗脫同樣要控制流速以減少目標物流失，造成檢驗結果出現大的偏差[5]。