熒光分光光度法測定飼料中二氫吡啶的含量

◎ 戎筱卿

（蘇州衛生職業技術學院，江蘇 蘇州 215009）

二氫吡啶是一種非營養性飼料添加劑，現已取代瘦肉精成為國內最常使用的飼料添加劑[1]。研究表明，二氫吡啶具有促進豬、雞、牛、羊、魚的生長，改善畜禽和魚產品品質，提高豬、牛、羊、兔的繁殖性能及防病多種功能。所以，有必要對飼料中的二氫吡啶的含量加以控制。目前，測定飼料中二氫吡啶含量的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法等[2]。但紫外分光光度法靈敏度低，特異性低，檢測結果不準確；高效液相色譜法操作繁瑣，分析時間長，不利于快速分析[3]。二氫吡啶天然具有熒光，但目前尚未利用熒光分光光度法測定二氫吡啶的含量[4]。所以，本實驗擬采用熒光分光光度法建立飼料中二氫吡啶含量的測定方法，并運用于質量控制[5]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計，島津-GL通用儀器有限責任公司；KQ-300DA型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平XS205，Mettler Toledo。

二氫吡啶對照品，中國藥品生物制品檢定研究院，批號170322，純度為99.0%；氫氧化鈉、磷酸、甲酸，均為分析純；飼料從多個獸藥店采集，水為蒸餾水。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液

精密稱取二氫吡啶對照品15.20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈適量超聲溶解，定容至刻度，作為對照品儲備溶液。精密移取儲備液1 mL置于100 mL棕色容量瓶中，加1%磷酸乙腈定容至刻度，即得濃度約為1 μg/mL的對照品使用溶液[6]。

1.2.2 供試品溶液

取飼料100 g研細，混合均勻，精確稱取10 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液60 mL，0 ℃水浴超聲20 min，取出，用1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻。13 000 r/min離心5 min，移取上清液1 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，即得。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

準確移取1.2.1中制得的對照品使用溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入1%磷酸乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度依次為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL對照品溶液（L1-L5）。以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，在Ex 363 nm、Em 448 nm下測定其吸光度[7]。以吸光度A為縱坐標、濃度c為橫坐標繪制曲線，計算回歸方程為A=545.9c+54.8，r=0.997 0。結果表明，二氫吡啶在0.05～1.00 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.2 測定波長的選擇

準確移取1.2.1中制得的二氫吡啶對照品使用溶液適量，以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，將對照品溶液在激發波長220～400 nm、發射波長400～600 nm進行掃描，結果如圖1所示。由圖1可知，其最大激發波長為363 nm，最大發射波長為448 nm。

圖1 二氫吡啶乙腈溶液的激發、發射光譜圖

2.3 空白溶液的紫外光譜

配制1%磷酸乙腈溶液，按2.2項測定，結果如圖2所示。由圖可知，空白溶劑在最大激發波長363 nm、最大發射波長為448 nm處無明顯吸收。

圖2 1%磷酸乙腈溶液的激發、發射光譜圖

2.4 精密度實驗

移取2.1項下二氫吡啶對照品溶液L3適量，于Ex 233 nm、Em 464 nm下測定吸光度，重復6次，測得熒光強度，計算得RSD為0.61%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗

精確稱取2號飼料10 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供試品溶液的制備項處理，測定，計算含量，結果6份測定值RSD為3.75%。

表1 重復性實驗表

2.6 檢測限

取1%磷酸乙腈溶液適量，在Ex 233 nm、Em 464 nm下測定熒光強度，重復11次，計算SD。按公式（1）計算該方法的檢測限。

式（1）中，k為標曲的斜率。計算得檢測限LOD為 0.013 μg/mL。

2.7 穩定性考察

精確稱取2號飼料10 g，3份，置于100 mL棕色容量瓶中，按1.2.2中的供試品溶液的制備項處理，分別于0m、20、40、60、120 min測定其熒光強度，計算RSD[8]。結果發現均小于2%，說明該對照品溶液2 h內基本穩定，不影響含量測定。

2.8 回收率實驗

精確稱取2號飼料5 g，6份，置于100 mL棕色容量瓶中，再分別加入二氫吡啶對照品儲備溶液0.5 mL，按1.2.2中的供試品溶液的制備項處理，測定其熒光強度，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗表

2.9 樣品測定

移取1.2.2項下供試品溶液適量，以1%磷酸乙腈溶液為空白溶劑，在Ex 233 nm、Em 464 nm下測定熒光強度，重復測定3次，取平均值，計算其含量，結果見表3。

表3 含量測定表

3 結果與討論

3.1 提取溶劑的選擇

二氫吡啶微溶于水，能溶于熱乙醇、乙腈[9]。所以，本實驗選擇乙腈為提取溶劑[10]。本實驗考察了二氫吡啶的1%甲酸乙腈、1%磷酸乙腈、1%氫氧化鈉乙腈溶液的熒光強度，發現：1%甲酸乙腈會導致熒光淬滅，1%磷酸乙腈和1%氫氧化鈉乙腈溶液的熒光強度接近?？紤]到化合物的穩定性，最終采用1%磷酸乙腈作為樣品提取溶劑。

3.2 檢測波長的確定

本實驗分別掃描了二氫吡啶1%磷酸乙腈溶液及空白溶劑的熒光激發和發射光譜，二氫吡啶的最大紫外吸收波長為230 nm、363 nm處，最大發射波長為448 nm?？紤]溶劑干擾，確定了最大激發波長為363 nm、發射波長448 nm，作為定量測定波長。

3.3 方法的優勢

二氫吡啶作為普遍使用的飼料添加劑，一般的添加比例為0.01%～0.02%，現有測定方法主要是紫外分光光度法，靈敏度低，難以滿足飼料的測定要求[11]。二氫吡啶天然具有熒光，利用熒光分光光度法測定可以取得更低的檢測限，達到檢測飼料中微量添加二氫吡啶的要求。

4 結語

采用熒光分光光度法測定飼料中二氫吡啶的含量，方法簡便快捷，數據可靠準確，可作為飼料中二氫吡啶含量的測定方法。