二甲雙胍及有氧運動對肥胖大鼠骨骼肌脂聯素和葡萄糖轉運體4的影響

童俊露，王佑民，鄧大同

(1.泰康仙林鼓樓醫院，江蘇 南京 210046；2.安徽醫科大學內分泌與代謝病研究所，安徽 合肥 230022；3.安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科，安徽 合肥 230022)

近年來，隨著生活日益改善，肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等內分泌代謝病的發病率明顯增加，胰島素抵抗是這些疾病共同的發病機制。脂聯素(APN)作為脂肪因子可調節脂肪酸氧化和葡萄糖代謝，目前作為骨骼肌因子的研究正在探索中。葡萄糖轉運體4(GLUT4)是骨骼肌以及脂肪細胞中最重要的葡萄糖轉運體，亦可調節糖脂代謝。二甲雙胍及運動是最常用的改善胰島素抵抗的方法。本研究通過高脂飲食建立肥胖及胰島素抵抗模型，了解二甲雙胍及運動干預對骨骼肌中APN和GLUT4表達產生的影響，探討APN及GLUT4在骨骼肌糖代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性4周齡清潔級SD大鼠50只，購自安徽醫科大學動物實驗室。本研究符合一般動物實驗倫理的要求。本研究起止時間為2013年1月至2016年9月。

1.2飼料普通飼料(動物中心配制)，成分配比為：豆粕30%、高粱10%、玉米30%、標準粉10%、魚粉10%、骨粉2.5%、酵母2.5%、黃豆5%；高脂飼料成分配比為：普通飼料55%、豬油12%、麻油3%、雞蛋10%、花生5%、蔗糖5%、奶粉8%、食鹽2%。

1.3試劑及儀器鼠胰島素放免試劑盒(北京北方生物研究所)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物研究所)；兔抗鼠APN(Acrp30)抗體、兔抗鼠GLUT4抗體(均為美國BIOWORLD公司)、β-actin一抗(美國 Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗及兔抗鼠二抗(均為北京中杉金橋生物有限公司)；鹽酸二甲雙胍腸溶片(施貴寶公司提供)；全自動生化分析儀(瑞士Roche Modular DPP公司)。

1.4大鼠飼養及干預分組50只SD雄性大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法，分為普通對照組(NC組，11只)和高脂飼料組(HD組，39只)。NC組給予普通飼料繼續喂養，HD組大鼠換為高脂飼料喂養，定期稱重，12周后，篩選36只造模成功的肥胖大鼠(體質量高于NC組20%認為造模成功)采用隨機數字表法分為游泳運動組(SE組，10只)、二甲雙胍組(MT組，11只)、高脂肥胖組(HF組，11只)，另有7只大鼠在實驗過程中因溺水、灌胃嗆咳等原因死亡。SE組大鼠每天下午3點進行游泳運動，泳池為高1.5 m，直徑2 m的圓柱形容器，運動時維持水溫在(23±2)℃，每周6天，第1周每天20 min，之后每周每天增加15 min，直至每天1 h。MT組大鼠每只每天給予200 mg·kg-1的二甲雙胍溶液灌胃，二甲雙胍溶液為注射用水新鮮配制的混懸液，每只大鼠灌胃體積2 mL左右。所有大鼠均可自由進食，自由進水，生活環境溫度為(25±1)℃，共干預6周。

1.5血清指標檢測禁食8 h過夜，10%水合氯醛麻醉，稱量體質量(BW)，下腔靜脈采血，2 500 r·min-1離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱中保存以備測定各項代謝指標。分離腓腸肌組織，液氮中凍存。

使用全自動生化儀測各項指標：空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)。空腹胰島素(FINS)水平使用鼠胰島素放免試劑盒測定。

計算胰島素抵抗指數：(HOMA-IR)=FBG(mmol·L-1)×FINS(mIU·L-1)/22.5。

1.6骨骼肌組織中APN、GLUT4的蛋白表達的程度取約100 mg的腓腸肌組織，冰上勻漿后加入細胞裂解液充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白含量，標記后置于-80 ℃保存。取等量蛋白沸水煮5～10 min變性后加樣，SDS-PAGE電泳分離，轉移至NC膜上，TBST封閉，分別加入APN(Acrp30)一抗(1∶300)、GLUT4一抗(1∶1 000)及β-actin 一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)孵育2 h，ECL曝光、顯影、定影，蛋白質印跡法所得條帶使用凝膠處理軟件掃描成圖片，分析目標條帶灰度值。骨骼肌中的APN、GLUT4的灰度值與 β-actin的灰度值比值為蛋白的相對表達量，進行統計學分析。

表1 各組大鼠代謝相關指標的測定

注：整體分析為單因素方差分析；多重比較為HSD-t檢驗，角標a、b、c分別為與A、B、C組比較，P<0.05

2 結果

2.1血清學指標兩兩比較并結合主要數據分析：與正常對照(NC組)相比較，HF組大鼠的BW、FBG、TG、TCH、FINS、HOMA-IR指數均明顯增高(P<0.05)。與HF組相比，SE、MT組BW、FBG、TCH、HOMA-IR指數下降(P<0.05)，SE組血TG下降(P<0.05)，MT組血中TG雖有所下降但差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠骨骼肌組織中APN、GLUT4的蛋白表達兩兩比較并結合主要數據分析：與NC組相比，HF組骨骼肌中APN、GLUT4的蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；與HF組比較，SE組及MT組骨骼肌組織中GLUT4的表達均明顯增加(P<0.05)；與HF組相比，SE、MT組骨骼肌組織中APN的表達明顯增加(P<0.05)；SE組、MT組之間GLUT4的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

表2 各組間大鼠骨骼肌組織APN、GLUT4蛋白表達比較

注：整體分析為單因素方差分析；多重比較為HSD-t檢驗，角標a、b、c分別為與A、B、C組比較，P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是指機體對胰島素的敏感性下降，是2型糖尿病、代謝綜合征等內分泌相關疾病主要的發病機制，改善胰島素抵抗，是多種疾病防治的核心。高脂飲食誘導大鼠肥胖及胰島素抵抗的發生與人類肥胖及胰島素抵抗的發病過程相類似，通常用于建立動物模型。本實驗研究亦采用了這種方法造模，與普通對照大鼠相比，高脂飼料喂養的大鼠體質量增加大于20%，HOMA-IR指數明顯增高，FBG、TG、TCH增高，FINS水平增加，提示肥胖及胰島素抵抗大鼠造模成功。

APN最早在脂肪組織中發現，作為脂肪因子與脂聯素受體結合可降低FBG、TG水平，調節糖脂代謝，具有改善胰島素敏感性、抗動脈粥樣硬化等保護作用[1]。近年來，在骨骼肌中也發現APN的表達，骨骼肌中APN的表達和調節是目前研究新方向。Esfahani等[2]多位學者在大鼠及人類的骨骼肌組織中均發現了APN的存在，有學者證實骨骼肌可以通過分泌APN，上調脂肪酸的氧化應激，減少三酰甘油含量，促進骨骼肌細胞中葡萄糖氧化，改善胰島素敏感性。骨骼肌細胞膜GLUT4介導的葡萄糖轉運是糖代謝中的限速步驟，在糖尿病SD大鼠模型中，GLUT4的高表達明顯降低其空腹血糖[3]。體外實驗顯示，在高胰島素的環境中骨骼肌細胞GLUT4的表達明顯降低，且同時伴發轉位障礙[4]。GLUT4在骨骼肌細胞膜中的轉位途徑有兩種類型：(1)胰島素依賴型途徑：胰島素及胰島素類似物與胰島素受體結合，激活GLUT4發生膜轉位；(2)非胰島素依賴性途徑：由于運動、缺血、缺氧等因素，直接激活GLUT4膜轉位過程[5-7]。高脂喂養的SD大鼠骨骼肌組織中，胰島素信號轉導途徑中受體水平缺陷，使得GLUT4mRNA表達明顯下降和GLUT4蛋白含量降低，從而導致葡萄糖轉運、攝取、利用的減少及胰島素抵抗的發生[8]。本研究結果得出類似結論，高脂飼料喂養的肥胖胰島素抵抗大鼠的血糖、血脂較正常對照組明顯增加，骨骼肌中APN及GLUT4明顯降低，證實了APN和GLUT4的下調與胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂相關。

運動鍛煉是臨床中最常見改善胰島素抵抗的生活調節方式。運動可以直接增加機體骨骼肌中GLUT4的表達和蛋白質的合成，促進GLUT4跨膜轉運過程；增加骨骼肌細胞膜上胰島素受體數量，使得胰島素與受體結合增加，促進骨骼肌細胞GLUT4的膜轉運，使GLUT4的含量提高；在運動鍛煉肌肉收縮過程中，增加了細胞內鈣離子含量，從而激活了鈣調蛋白激酶活性來增加GLUT4的表達；同時運動過程中由于體內的ATP大量消耗，AMP的增加激活了AMPK介導的信號轉導途徑，GLUT4的膜轉位增加，肌肉組織攝取和利用葡萄糖增加，從而改善胰島素抵抗[9-11]。在本實驗中，SE組較HF組FBG、TG、TCH下降，HOMA指數降低，骨骼肌中GLUT4的表達明顯增高，進一步證實運動可以增加GLUT4的表達。目前針對運動對APN水平的影響尚有爭議，有學者發現運動不能改變APN的水平，可能不是運動改善胰島素敏感性的因子之一；國內另有研究發現，運動對血清及骨骼肌中APN均有上調作用[12]。在本研究中，SE組骨骼肌中APN表達較HF組明顯增高，血脂、血糖降低，胰島素抵抗改善，具體機制尚不明確，考慮可能與運動激活AMPK等信號通路有關，進一步促進GLUT4的轉位。

二甲雙胍是臨床上最常用于改善胰島素抵抗的藥物，可以抑制糖異生，增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用，提高胰島素敏感性。二甲雙胍可增加糖尿病模型中骨骼肌中GLUT4 mRNA和蛋白表達，促進胰島素介導的骨骼肌GLUT4跨膜轉運，增加外周組織對葡萄糖攝取促進。本研究在肥胖大鼠胰島素抵抗模型中亦得到上述結論，二甲雙胍干預的MT組大鼠骨骼肌組織中GLUT4的表達較HF組明顯增加，作用機制可能為二甲雙胍在改善胰島素抵抗的同時可能直接促進GLUT4的表達。有關二甲雙胍對組織APN表達的影響尚存不同的觀點。Zulian 等[13]通過體內、體外實驗證明二甲雙胍可增加脂肪細胞和脂肪組織中APN的表達。有研究認為，二甲雙胍對血清APN無明顯改善作用[14]，但國內有學者研究發現，二甲雙胍可升高2型糖尿病患者中血清APN的水平[15]。二甲雙胍對骨骼肌細胞和組織中的APN的表達作用目前報道較少。

本實驗中發現二甲雙胍可增加骨骼肌GLUT4的表達，改善胰島素抵抗和糖脂代謝，但并未顯著增加骨骼肌APN的表達，具體機制目前尚不十分明確，但由于本實驗干預時間短，樣本量較小，二甲雙胍及運動對骨骼肌APN的作用有待今后進一步探討研究。

(本文圖1見插圖10-1)