瓊脂塊檢測篩選法在阿維菌素育種中的應用研究

崔莉

摘要：現有技術中阿維菌素自然選育流程耗時長、篩選效率低、設備及功能間的利用率低，因此，提供一種快速初篩方法對于阿維菌素的生產來說具有非常重要的意義。

Abstract： In the prior art， the natural selection process of Abamectin takes a long time， the screening efficiency is low， and the utilization ratio of equipment and function room is low. Therefore， it is very important to provide a rapid screening method for the production of Abamectin.

關鍵詞：瓊脂塊檢測篩選法；阿維菌素育種；高效育種

Key words： agar block detection and screening method；Abamectin breeding；efficient breeding

中圖分類號：Q933 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2018）29-0244-02

1 研究依據

阿維菌素是由鏈霉菌中灰色阿佛曼鏈霉菌發酵產生，由一組十六元大環內酯化合物組成，是高效、廣譜的抗生素類殺蟲劑。目前，阿維菌素自然選育流程如下：選擇出發株→制備分離平板培養基→制備單孢子懸浮液→涂布分離培養→挑單菌落接斜面→搖瓶初篩→初篩留種→接復篩斜面→搖瓶復篩→復篩留種→性狀考察→高產菌種復篩留種。

現行工藝操作繁瑣、周期偏長，從單菌落培養到菌種性能的初篩檢測長達35天左右，其缺陷為：流程繁瑣、選育周期長、工作量大、需專用設備（恒溫振蕩器）、能耗大、成本高、篩選效率低。因此，在菌種選育“初篩以量為主、復篩以質為主”的篩選原則下，提供一種快速初篩方法對于阿維菌素的生產來說具有非常重要的意義。

抑菌圈法又叫擴散法，成本低廉、結果準確可靠，操作便捷、簡單易行，是抗生素產生菌初篩快速有效分離的篩選方法。其方法是，將待檢測菌種的單菌落瓊脂塊移至含有試驗菌的瓊脂塊培養基上，在適宜溫濕度下培養一段時間后取出，用游標卡尺來測定各抑菌圈的直徑，直徑大小反映了瓊脂塊產抗生素能力的大小，以此判斷擇優選取。由于阿維菌素沒有抑菌活性，其自身不能分泌抑制試驗菌生長的物質或分泌某種對試驗菌有毒的物質，當其轉入含試驗菌的培養基上就會被試驗菌所抑制甚至殺滅，所以阿維菌素菌選過程中效價的檢測不能采用抑菌圈法。

2 研究目的

本項目以縮短阿維菌素選育周期、提高篩選效率、節約篩選成本為研究目標，建立新的菌選方法、提高篩選效率。

3 研究內容

本項目采用瓊脂塊培養初篩法，過程為：生產菌種斜面培養，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養出單菌落，挑取單菌點種于固體培養基平板上，HPLC法檢測產素能力，挑取高產株搖瓶復篩，留種保藏。

4 研究方法

4.1 儀器與材料

①儀器：漩渦混合器、臺式低速離心機、安捷倫高效液相色譜儀。

②材料：出發菌株（生產菌株阿佛曼鏈霉菌Streptomyces avermitilis），分離（斜面）培養基、點種培養基、種子搖瓶培養基、發酵搖瓶培養基；丙酮（分析純）、甲醇（分析純）、無水甲醇（色譜純），有機濾膜。

4.2 培養基

4.2.1 分離（斜面）培養基（g/L）：

可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、瓊脂粉20；pH7.2～7.4，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4.2.2 點種培養基（g/L）：

1#——可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、瓊脂粉20、pH7.2～7.4，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

2#——玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏4.0、CaCO3 3.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

3#——玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米漿2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4#——玉米淀粉25、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米漿4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4.2.3 搖瓶種子培養基（g/L）：

玉米淀粉25、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米漿4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自來水配制，121℃滅菌30min。

4.2.4 搖瓶發酵培養基（g/L）：

玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米漿2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自來水配制，121℃滅菌30min。

4.3 方法

4.3.1 培養方法

①分離平皿的制備：挑選生長飽滿的工作細胞庫斜面，加入15ml無菌水，用接種環刮取孢子，將其懸浮在無菌水中制成混合均勻的孢子懸浮液。用無菌濾紙過濾收集孢子液，并進行10-1～10-6梯度稀釋，取10-5、10-6稀釋液0.1～0.15ml注入于分離培養基上，用三角耙耙勻，倒置于恒溫室28±1℃培養7～9天。

②點種平皿的制備：取培養至第5～7天的上述分離平板，用肉眼篩出飽滿、均勻、分泌孢子量大、形態規整以及經驗型產抗能力差的單菌落，在背面標記序號；并在點種培養基背面標記相應的序號（1個分離單菌落對應2個點種菌落序號；分別用3-1、3-2標示），用無菌牙簽輕輕點種于相應序號位置標記處的點種培養基上，點種培養平皿倒置于恒溫室28±1℃培養10～12天；分離平皿倒置于恒溫室28±1℃繼續培養2天左右，觀察菌落的生長變化。

③斜面制備：用點種肉眼篩選方法選取優質單菌落和點種后帶序號的單菌落，用接種環挑取單菌落接種于斜面培養基上，倒置于恒溫室28±1℃培養7～9天。

④種子搖瓶：將培養好的斜面菌種用接種鏟鏟取1.0cm*1.0cm接種于種子搖瓶培養基中，28±1℃、220r/min振蕩培養25～30hr，觀察其菌絲生長情況。

⑤發酵搖瓶：將培養成熟的種子液按10%的接種量轉接于發酵搖瓶中，28±1℃、220r/min振蕩培養10天。

4.3.2 初篩

①液體搖瓶復篩：

取4.3.1⑤培養好的發酵液10ml于離心管中，3000r/min離心10min，棄去上清液。加入丙酮10ml，在漩渦混合器上振蕩提取5min，靜置10min，再經3000r/min離心10min得萃取液，經0.45u有機濾膜過濾，準確吸取5.0ul樣品濾液進樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產能力。

②瓊脂塊培養初篩：

分別將兩塊4.3.1②培養好的、同序號點種單菌落鏟下置于同一離心管中，加10ml分析純甲醇，在漩渦混合器上充分振蕩3min提取，4000r/min離心10min、靜置10min后，經0.45u有機濾膜過濾，準確吸取5.0ul樣品濾液進樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產能力。

5 研究結果與分析

5.1 結果

5.1.1 點種培養基優化試驗結果：點種培養基設計見4.2.2。點種菌落生長情況如下：1#培養基：菌落呈饅頭型、山丘型，孢子分泌量少；2#培養基：菌落呈草帽型、類草帽型，孢子分泌量多；3#培養基：菌落呈十字型、光禿型，孢子幾乎無分泌；4#培養基：菌落呈光禿型、饅頭型，孢子分泌量無或很少。

5.1.2 搖瓶初篩、瓊脂塊初篩及復篩HPLC檢測結果對照（表1）

5.1.3 常規搖瓶初篩流程與改進瓊脂塊培養初篩流程選育周期對比：搖瓶初篩流程選育周期為26～31天；瓊脂塊培養初篩流程為11～13天，相對比縮短培育期15～18天。

5.2 分析

通過4批共30株菌株的點種試驗，得到單菌落的表型分布有6種，分別是：草帽型、類草帽型、饅頭型、十字型、光禿型、山丘型；結合表1與搖瓶復篩試驗結果可得知：這6種形態的菌落其產抗能力依次為：草帽型、類草帽型、饅頭型、山丘型、十字型、光禿型；從表1：搖瓶初篩與瓊脂塊培養初篩HPLC檢測結果對照表來看，搖瓶復篩效價高的菌株其瓊脂塊培養初篩效價亦表現高；從表1：高產菌株復篩考察來看，點種后培養成熟的單菌落傳斜面，經搖瓶考察產抗能力良好的菌株，其經菌種保藏后再次復篩驗證，其仍能保持良好的初篩性能；從搖瓶初篩流程與瓊脂塊初篩流程選育周期對比來看，瓊脂塊培養初篩選育新工藝可縮短15～18天；提高篩選效率、節約篩選成本。

6 研究結論

①瓊脂塊初篩選育新工藝可較傳統搖瓶初篩選育周期縮短近半個月，提高篩選效率、節約篩選成本。②瓊脂塊初篩選育新工藝得到的菌株性能與相應的增殖斜面得到的驗證結果能有效對應。③瓊脂塊初篩選育法篩出的的優良菌株，復篩性能穩定。

參考文獻：

[1]陳紅霞.阿維菌素生物合成基因改造的研究[D].沈陽藥科大學，2002.

[2]李燕霞，喬建軍.阿維菌素B1a組分高產菌株的定向選育[J].工業微生物，2008（01）.

[3]陳芝，溫嘉，宋淵，文瑩，李季倫.阿維鏈霉菌種內原生質體融合選育僅產阿維菌素B的高產菌株[J].科學通報，2007（03）.