重慶合川區豬源沙門氏菌的分離鑒定及藥敏分析

艾鑫，董欣煒

（1.天津威特生物醫藥有限責任公司，天津 300301；2.康地飼料添加劑（北京）有限公司，北京 100020）

沙門氏菌是一種重要的人獸共患病病原，廣泛存在于自然界、人和動物腸道，能夠引起人類和多種動物發病，如人的傷寒、副傷寒，豬副傷寒，禽類的雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，反芻動物腹瀉等。更為重要的是，該菌常常污染動物性食品，隨食物鏈進入人體。近年來，隨著抗菌藥物大量使用，多重耐藥沙門氏菌菌株廣泛出現，這更增加了動物源沙門氏菌感染人類發病之后的治療難度，增加治療成本。

為了解重慶市合川區豬源耐藥沙門氏菌的流行情況，為養殖企業的臨床用藥提供指導，本試驗對合川區部分豬場的沙門氏菌進行了分離鑒定，并測定其對26種抗菌藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙門氏菌菌株 CQFL7PS001菌株由本公司實驗室保存。

1.1.2 試劑及藥品 MH培養基、沙門氏志賀氏菌屬增菌培養基、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；XLD培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司。26種藥敏紙片包括：（1）β-內酰胺類：（A）青霉素類：氨芐西林，（B）頭孢菌素類：頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟，（C）碳青霉烯類：亞胺培南，（D）單環內酰胺類：氨曲南；（2）氨基糖苷類：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星；（3）四環素類：四環素、多四環素；（4）酰胺醇類：氯霉素、氟苯尼考；（5）喹諾酮類：萘啶酸、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、依諾沙星；（6）磺胺類：復方新諾明、甲氧嘧啶。

1.1.3 樣品采集 2017年11月至2018年3月于重慶市合川區的3家規模化養豬場采集豬糞樣品：用無菌棉簽取1 g左右的糞便于2mL滅菌離心管中。采集的所有樣本均置于有冰袋的泡沫箱中，6h之內運回實驗室進行處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 在每個裝有豬糞便的離心管中加入1mL PBS，振蕩后靜置2h，使細菌從糞便中游離出來。重懸后吸取200μL PBS于滅菌的沙門氏志賀氏菌屬增菌液中，220r/min 37℃培養6～12h，樣品增菌后，將菌液劃線于XLD瓊脂平板，37℃培養24～28h。

1.2.2 沙門氏菌疑似菌株的形態學觀察 從XLD平板劃線區挑取3個圓形、光滑的單菌落接種于LB瓊脂平板，37℃培養48h，再從LB平板上挑取單菌落，革蘭氏染色后觀察細菌形態。根據形態觀察結果，將疑似細菌菌落再次接種于LB液體培養基，37℃220r/min振蕩培養8h。

1.2.3 沙門氏菌分子生物學檢測

（1）沙門氏菌特異性基因的引物設計與合成：根據GenBank中公布的invA基因全序列，用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計特異性引物，交由英濰捷基公司合成。引物序列invA-F：5′-GTGAAATTAT CGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-R：5′-TCATCGCAC CGTCAAAGGAACC-3′。

（2）PCR模板的制備：將疑似菌落接種于LB液體培養基，37℃ 220 r/min振蕩培養8 h；取1.5 mL菌液于室溫下13000r/min離心2min，棄上清；加入1 mL滅菌ddH2O重懸，室溫下13000r/min離心2min，棄上清；加入 70 μL ddH2O，105℃處理 10 min，然后置于冰上冷卻，以13 000r/min離心1min，取上清作為PCR反應的模板，-20℃保存備用。

（3）沙門氏菌的PCR鑒定：PCR擴增反應體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，invA-F（10 pmol/μL）0.5μL，invA-R（10pmol/μL）0.5μL，模板 DNA 0.5μL，ddH2O 11μL，總反應體系25μL。PCR反應條件：94℃預變性 5 min；94℃變性 15 s，58℃退火 15 s，72℃延伸30s，共30個循環；72℃延伸6min。

1.2.4 藥物敏感性試驗 采用KB紙片擴散法將保存的菌種劃線接種于LB平板，37℃培養20h左右；挑取單菌落接種于LB液體培養基，37℃ 220 r/min振蕩培養至菌液OD600值為0.11（0.5個麥氏比濁單位）；用移液槍吸取100μL菌液至Mueller-Hinton平板，用無菌棉簽均勻涂抹，室溫放置3～5min；待培養基表面水分吸干后，用眼科鑷將藥敏紙片貼于平板表面（紙片一旦與平板接觸不應再移動），每個紙片中心相距大于24mm，紙片距平板內緣大于15mm，于37℃恒溫箱培養15h后，測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。藥物敏感性結果根據《動物源抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執行標準》和《抗菌藥物敏感性試驗執行標準第二十五版資料增刊》判定。

2 結果

2.1 菌株分離情況 通過形態學觀察和PCR鑒定，在50份糞便樣品中分離到10株沙門氏菌，分離率為20.0%。分離的10株菌均能特異性地擴增出284bp的invA基因片段（圖1）。

圖1 沙門氏菌PCR鑒定結果

2.2 藥敏試驗結果 本次在合川區分離的菌株對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、鏈霉素、氧氟沙星完全敏感；對頭孢西丁、氨曲南的敏感性也較高，僅1株有耐藥性；對四環素、氟苯尼考完全耐藥；對慶大霉素、多西環素、氯霉素、環丙沙星、甲氧嘧啶的耐藥率為90%；對卡那霉素、復方新諾明的耐藥率為80%；對萘啶酸的耐藥率為70%；對頭孢氨芐的耐藥率為50%；對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、亞胺培南、阿米卡星、諾氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星的耐藥率在20%～40%（詳見表1）。所有菌株均為多重耐藥菌株，除1株分離菌外，其余菌株均對10種及以上藥物耐藥，特別是菌株1、2、3、5，耐藥數量超過50%。

表1 10株沙門氏菌對不同抗菌藥物的敏感性

3 討論

沙門氏菌是一類在世界范圍內廣泛存在的食源性細菌[1]，我國22.2%的食源性疾病由沙門氏菌引起，是第四大食源性疾病[2]。沙門氏菌血清型眾多，目前已經發現超過2600種血清型[3]。根據宿主感染范圍，沙門氏菌分為宿主適應性血清型和非宿主適應性血清型。非宿主適應性血清型指能感染多種動物和人的血清型，如鼠傷寒沙門氏菌、德爾俾沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等。

近30年來，抗菌藥物在動物養殖上的廣泛應用使得耐藥菌株迅速增加，有研究者報道，食品動物中抗菌藥物的濫用和病原菌耐藥之間存在密切聯系[4]。沙門氏菌多重耐藥菌株的出現，已經嚴重影響到公共衛生安全。因此，對動物和動物源性食品中沙門氏菌耐藥性的監測，對于保證食品安全和貿易都十分重要[5-6]。

藥物敏感性試驗表明，所有分離菌株均為多重耐藥株，說明合川區養豬場使用抗菌藥物極其普遍和不規范。還存在對人用抗菌藥物的耐藥現象，如對碳青霉烯類抗生素——亞胺培南和單環內酰胺類抗生素——氨曲南均有耐藥性。從表1可見，10株臨床分離菌對亞胺培南和氨曲南分別有20%和10%的耐藥率。亞胺培南和氨曲南是人專用抗生素，在動物源性沙門氏菌中出現耐藥菌株，可能與其他耐藥質粒同時攜帶耐碳青霉烯類和單環內酰胺類藥物基因有關[7]。