半邊蓮生物堿類物質鑒定及對Hela細胞抑制作用研究

孫 堯，張 皓，孫佳明，張 輝*，高曉晨*

（1.長春工業大學，長春 130012；2.吉林省經濟管理干部學院，長春 130012；3.長春中醫藥大學，長春 130117）

半邊蓮是桔梗科（Campanulaceae）半邊蓮屬（Lobelia L.）植物半邊蓮（Lobelia chinensis）的帶根全草，在我國安徽、福建、廣東、廣西、貴州、海南均有生長。我國《中華本草》記載半邊蓮有祛痰、止咳、增強免疫力等功效[1-4]。目前，我國的半邊蓮屬植物的研究較少，主要停留在中草藥配伍方面的研究。生物堿是藥物常見的化學成分，同時作為被視為現代藥物的最主要來源之一，生物堿是一類常見于植物中的主要含氮有機化合物[5-8]。大部分生物堿類化合物成分具有抗腫瘤、抗感染抗菌等藥理活性[9-10]。本研究主要針對半邊蓮的生物堿類化學成分，對其化學結構及抗腫瘤活性進行研究，以期為半邊蓮的化學成分鑒定及其在抗腫瘤研究中的開發和應用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 半邊蓮藥材采由長春中醫藥大學提供。1640培養液（美國Hyclone公司產品），胎牛血清（康源生物公司產品），細胞培養板（英國NEB公司產品），牛血清白蛋白及MTT均由實驗室保存。所用試劑均為分析純。

1.2 分離和測試用儀器 Acquity UPLC-Synapt G2 MS色譜質譜聯用儀（Waters公司產品），LTQ型離子阱質譜儀（美國Thermo Fisher公司產品），高速逆流色譜儀（TBE 20上海同田生化技術有限公司產品），Eppendorf centrifuge 5810R 臺式高速大容量離心機（德國Eppendorf公司產品），GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備產品），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司產品），KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司產品），BS110S電子天平（德國賽多利斯股份公司產品），T-500型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司產品），酶標儀（ELX80 美國BIOTEK公司產品）。

2 實驗方法

2.1 半邊蓮生物堿類化學成分的提取 取干燥的半邊蓮全草0.5 kg進行粉碎，用5 L乙醇（95%）乙醇溶液超聲溶解，將乙醇溶液旋轉蒸發提取2次，每次旋蒸提取時間為3 h，提取溶液回收后進行冷凍干燥，冷凍干燥96 h。冷凍干燥成粉末后，取1 mg半邊蓮凍干粉經過超聲溶解法溶于10 mL正丁醇中，溶解后將10 mL正丁醇經氮吹儀吹干，將吹干后的溶質，溶于10 mL甲醇中制成制備液，用于后續檢測。

2.2 半邊蓮生物堿類化學成分質譜分析 Finnigan LTQ質譜儀：毛細管溫度250℃；噴霧電壓 4.0 kV，透鏡電壓 -250 V；毛細管電壓 -4 V；質量檢測范圍 m/z：200～1 500；注射泵流速 5 μL/min；鞘氣為氮氣流速40 mL/min。

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；進樣體積為10 μL；流動相流速為0. mL/min；柱溫為20℃，流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈；流動相C：甲醇。

2.3 單體生物堿的提取 根據分離生物堿的性質及生物堿甲醇溶液極性的大小，采用分析型HSCCC確定選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6:3:2:5，V/V）體系。經過超聲脫氣30 min后，在紫外波長254 nm下進行檢測。

采用制備型HSCCC進行分離制備。固定的流速20 mL/min，泵入HSCCC管柱中，管柱中流出50 mL后停泵，運行主機，調整流動相，使之達到兩相溶劑動態平衡，50 mL待分離樣品注入HSCCC 儀中，分離生物堿單體組分。紫外檢測波長柱溫25 ℃。根據色譜圖收集各組分。

2.4 Hela細胞培養 將細胞從- 80 ℃冰箱中迅速取出，置于37 ℃水浴鍋中，待細胞解凍后，漿細胞懸浮液加入15 mL離心管中，再向離心管中加入4 mL細胞培養液，1 000 r/min離心3 min后，棄上清，加入1 mL培養液吹勻，置于培養皿中，培養皿體系為9 mL培養液和1 mL血清。

待細胞在培養皿中鋪滿80%以上面積時，將皿中培養基全部棄掉，加入2 mL胰酶，37℃消化2～5 min，待皿中細胞不再貼壁時，加入1 mL血清和3 mL培養基吹起，加入15 mL離心管中離心，將沉淀用3 mL培養液吹起，平均分成3份，分入3個皿中，繼續培養。

2.5 Hela細胞MTT實驗 10%胎小牛血清加入到96孔板中，每孔加入1 000～10 000個胎牛血清得細胞懸浮液，每孔加入200 μL。待細胞完全貼壁后，每孔加入終濃度為1 mg/mL的各種中藥，繼續培養24 h。

培養24 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH = 7.4）20 μL繼續孵育4 h，吸取上清液并棄掉，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。酶標儀以490 nm波長檢測，各孔光吸值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。抑制率/% =（對照組OD值－測試組OD值）/對照組OD值×100

3 實驗結果

3.1 半邊蓮主要生物堿類化學成分分析 如圖1所示，在正離子模式下共鑒定出5個主要的化合物離子峰。對以上峰1～5峰進行二級譜碎裂MS/MS分析顯示，根據保留時間及二級普特征碎片及相關文章參考，鑒定出化合物2，3，4，5為8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜堿B，新山梗菜堿A及山梗新堿如表1所示，其主要碎裂方式為失去1分子2-丁酮（72 Da），失去1分子丙酮（58 Da），或失去1分子甲基（14 Da），化合物1為未知化合物，根據二級普碎裂方式推測可能結構式如圖2所示。

3.2 新山梗菜堿B和新山梗菜堿A逆流色譜提取 本研究采用HSCCC提取含量較高的新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿，分別得到5 mL新山梗菜堿B和5 mL新山梗菜堿A溶液，以硫酸山梗堿為標品，采用紫外分光光度計，繪制硫酸山梗堿含量標準曲線，通過制硫酸山梗堿標準曲線計算新山梗菜堿B和新山梗菜堿A含量，新山梗堿B含量為3.2 mg/mL，新山梗菜堿A含量為2.4 mg/mL。5 mL新山梗菜堿B和新山梗菜堿A經氮吹后。加水配置1 mg/mL的溶液以備Hela細胞MTT檢測用。

圖1 梗菜中主要生物堿類化合物總離子流圖

圖 2 定出山梗菜的主要生物堿化學結構式及碎裂方式，紅色虛線表示MS/MS特征碎片化學鍵斷裂方式

3.3 半邊蓮提取物及其單體生物堿對Hela細胞MTT檢測 為了確定半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品是否對Hela細胞的生長具有抑制作用，筆者對梗菜提取物及其單體生物堿樣品對Hela細胞進行MTT檢測。如表2所示，MTT實驗中加入半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品后，對Hela細胞生長具有抑制作用。其中培養24 h后，抑制率達到最高。同時可以看出半邊蓮醇提取物對Hela細胞生長的抑制效果不如相同濃度下半邊蓮單體生物堿對Hela細胞生長的抑制率，所以可以確定山梗菜中的生物堿對Hela細胞癌癥模型起抑制作用，且半邊蓮中起決定抗腫瘤效果的是半邊蓮中的生物堿成分，其中新山梗菜堿A對腫瘤細胞的抑制率略高于新山梗菜堿B。

表1 山梗菜中主要生物堿鑒定

表2 1 mg/mL樣品對Hela細胞生長抑制率

4 結論

本研究采用乙醇回流提取法及正丁醇萃取法，提取出半邊蓮中的主要活性成分，通過UPLC-MS及ESI-MS2的方法，共鑒定出5種半邊蓮中主要生物堿成分，通過二級譜碎裂及保留時間及相關文獻的查閱確定5種生物堿為8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜堿B，新山梗菜堿A，山梗新堿及一種未知生物堿并推測及結構式，通過HSCCC提取主要的2種生物堿新山梗菜堿B和新山梗菜堿A。并通過MTT法檢測半邊蓮總提取物、新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿分別在24、 48、72 h對Hela細胞的活性檢測。可以看出半邊蓮醇提物及其單體生物堿均對Hela細胞生長具有抑制作用，相同給藥濃度下半邊蓮醇提取物對Hela細胞生長的抑制效果不如半邊蓮單體生物堿對Hela細胞生長的抑制率，可以確定半邊蓮中的生物堿對Hela細胞癌癥模型起抑制作用。