益氣解毒中藥復(fù)方對急性電離輻射小鼠骨髓損傷的防護(hù)作用

徐文慧，李盼飛，王 磊，王 安，王天琪，高明澤，胡素敏

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

骨髓是人體重要的造血器官，對輻射高度敏感[1]，輻射導(dǎo)致的骨髓抑制主要表現(xiàn)為血細(xì)胞數(shù)減少、感染以及出血等急性損傷，其中以骨髓造血細(xì)胞損傷為最主要特征[2]。射線直接殺傷骨髓中的造血干細(xì)胞，骨髓組織中幼稚的紅、粒、巨核細(xì)胞大量死亡[3]，不能繼續(xù)生成血細(xì)胞，血細(xì)胞得不到補(bǔ)充，血細(xì)胞計數(shù)則會持續(xù)低下。電離輻射通過直接作用、間接作用對機(jī)體產(chǎn)生一系列損害，最終可引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[4-5]，導(dǎo)致骨髓損傷，造血障礙，免疫功能低下等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予以中藥為主要治法的中藥復(fù)方，可以提高受照后小鼠機(jī)體的免疫功能，從而在照后早期減少炎癥并發(fā)癥的發(fā)生[6]。而本文主要是研究該方對急性電離輻射小鼠骨髓損傷的防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 SPF級雄性Balb/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，40只，由斯貝福（北京）實(shí)驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）2011-0004。飼養(yǎng)于環(huán)境溫度（20±2）℃，濕度50%±10%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由攝食、飲水的飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)，實(shí)驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 實(shí)驗儀器 BD FASC antoII型流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；JY203電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)品；冷藏冰箱、超低溫冰箱，海爾電器有限公司產(chǎn)品；5417R小型臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；臺式冷凍離心機(jī)，湘儀檢測設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MP5002型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗設(shè)備廠產(chǎn)品。MK3型酶標(biāo)儀，熱電（上海）科技儀器有限公司產(chǎn)品。搖床，其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗試劑 PBS磷酸鹽（批號：No.529G021），北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（批號：4293719）、FITC Rat Anti-Mouse CD34（批號：3331656）、PE Rat lgG2a k Isotype Control（批號：3130649）、FACS Lysing Solution（批號：3281668），美國BD公司產(chǎn)品。Mouse TNF-α Sunny ELISA Kit（批號：228251055），聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4 藥物制作方法 中藥復(fù)方的中藥飲片均購自北京同仁堂藍(lán)色港灣店，經(jīng)臨床中藥學(xué)教研室老師鑒定為真品，由本實(shí)驗室自行制備成水煎液。中藥復(fù)方煎煮2次，合并藥液，濃縮至原藥材的1～2 g/mL，60%乙醇除雜。給藥劑量為人臨床用量的10倍（即人臨床等效量），藥物濃度為 0.686 g/mL。鹽酸小檗胺片，由四川中方制藥有限公司提供，批號：150501。用去離子水溶解，給藥劑量為人臨床等效用量2.4 mg/mL。

1.5 動物分組、造模及給藥方法 小鼠在SPF級動物室中喂養(yǎng)3 d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、小檗胺組、中藥組。正常組，灌胃去離子水，0.2 mL/10 g體質(zhì)量；模型組，灌胃去離子水，0.2 mL/10 g體質(zhì)量；小檗胺組，灌胃小檗胺水溶液，0.2 mL/10 g體質(zhì)量；中藥組，灌胃相應(yīng)藥液，0.2 mL/10 g體質(zhì)量，均灌胃14 d。第14天灌胃后，除空白組小鼠外，其他各組小鼠進(jìn)行一次性全身60Coγ射線照射，建立急性輻射損傷模型。照射采用北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院鈷源，將小鼠固定于帶氣孔的樹脂鼠籠中，對小鼠進(jìn)行全身一次性60Coγ射線照射，照射劑量為3.5 Gy，照射劑量率為0.455 Gy/min。各組照射后不再灌胃給去離子水或藥物，照射后第4天取材。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 外周血細(xì)胞計數(shù) 小鼠摘眼球取全血80 μL，用EDTA-K2抗凝，于全自動血細(xì)胞分析儀檢測外周血細(xì)胞數(shù)，包括白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、血小板數(shù)（PLT）。

1.6.2 骨髓組織病理檢查 每組取6只小鼠胸骨，置于10%中性福爾馬林中固定24 h后，浸泡在脫鈣液中脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm石蠟切片，60℃烘箱烤片，HE染色。然后在顯微鏡下觀察骨髓造血組織病理變化。

1.6.3 骨髓CD34+細(xì)胞檢測 每組選取6只小鼠，分別剝?nèi)」晒牵米⑸淦魈咨系?號針頭吸取1 mL的PBS液反復(fù)沖洗骨髓，將骨髓細(xì)胞沖入1.5 mL離心管中離心，離心條件為300×g，4℃，5 min。去上清，加PBS液至0.5 mL，混勻，制備成單個骨髓細(xì)胞懸液。取120 μL骨髓細(xì)胞混懸液，加入CD34抗體3 μL抗體，室溫下避光反應(yīng)15 min。加入1 mL 1?的紅細(xì)胞裂解液，混勻，裂解10 min，直至透亮，室溫離心300×g，5 min。吸去950 μL上清，加入1 mL PBS，混勻，室溫離心300×g，5 min。加200 μL PBS后流式細(xì)胞儀檢測。

1.6.4 骨髓細(xì)胞周期檢測 取上述骨髓細(xì)胞混懸液180 μL，加上420 μL的冰冷的無水乙醇固定。加冰冷的0.6 mL PBS，離心300×g、4℃、5 min，去上清，加1 mL PBS，離心300×g，4℃、5 min，去上清。加200 μL PBS，加RNA酶A（1 mg/mL）至終濃度為50 μg/mL，37 ℃孵育40 min，加入PI至終濃度為20 μg/mL（約5 μL），5 min后流式細(xì)胞儀檢測。1.6.5 骨髓細(xì)胞凋亡檢測 將1.6.3的骨髓細(xì)胞混懸液 120 μL，加入 1 ? Binding Buffer 100 μL，混勻。加入3 μL FITC，輕輕吹打，室溫避光孵育15 min。加入3 μL PI，立即避光，流式細(xì)胞儀檢測，上機(jī)前再加入 100 μL 1 ? Binding Buffer。

1.6.6 外周血TNF-α檢測 取小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清中TNF-α含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）進(jìn)行統(tǒng)計描述，采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗。對于本實(shí)驗指標(biāo)如白細(xì)胞數(shù)等，正常組與各照射組數(shù)據(jù)相差很大，在比較時采用正常組與模型組比較，確定模型是否成功，然后單因素方差比較統(tǒng)計各照射組組間差異。所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血細(xì)胞計數(shù) 照射后4 d，與空白組比較，模型組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白濃度均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與模型組相比，小檗胺組外周血紅細(xì)胞數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），中藥組白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 小鼠外周血細(xì)胞計數(shù)（x± s ，n = 10）

2.2 骨髓組織病理檢查 正常組胸骨骨髓增生活躍，紅系、粒系、巨核系造血干細(xì)胞明顯。模型組胸骨骨髓增生低下，三系造血干細(xì)胞明顯減少，血管擴(kuò)張、充血，脂肪細(xì)胞增多，骨髓脂肪化明顯，血管大量出血。小檗胺組胸骨骨髓增生低下，三系造血干細(xì)胞明顯減少，血管擴(kuò)張、充血，脂肪細(xì)胞增多，骨髓脂肪化明顯，血管大量出血，較模型組稍好。中藥組胸骨骨髓增生稍有低下，三系造血干細(xì)胞明顯，骨髓稍有脂肪化，較模型組有明顯改善，好于模型組。見圖1（見插頁一）。

2.3 骨髓CD34+細(xì)胞檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組小鼠骨髓CD34+細(xì)胞比率有降低趨勢。預(yù)給藥干預(yù)后，小檗胺組、中藥組骨髓CD34+細(xì)胞比率較模型組有增多趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2，圖2（見插頁一）。

2.4 骨髓細(xì)胞周期檢測 見表3，圖3（見插頁一）。結(jié)果顯示，照后后4 d，與空白組相比，模型組 G0/G1期細(xì)胞比例降低，而 S 期細(xì)胞比例升高，G2/M期細(xì)胞比例減少，提示照射后4 d引起小鼠骨髓干細(xì)胞發(fā)生S期延遲。與模型組相比，小檗胺組、中藥組 G0/G1期細(xì)胞比例有升高的趨勢，S期細(xì)胞比例有降低趨勢，G2/M期細(xì)胞比例有升高趨勢。

2.5 骨髓細(xì)胞凋亡檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組、小檗胺組、中藥組小鼠骨髓細(xì)胞早期、晚期、總凋亡率均升高，預(yù)給藥干預(yù)后，小檗胺、中藥復(fù)方有減少骨髓細(xì)胞凋亡的作用趨勢，但不具有顯著性差異。見表4。

表2 CD34+細(xì)胞比率（x± s ，n = 6）

表3 小鼠骨髓細(xì)胞周期（x± s ，n = 6） %

表4 小鼠骨髓細(xì)胞凋亡（x± s ，n = 6）

2.6 外周血TNF-α檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組外周血TNF-α明顯升高（P＜0.05）， 預(yù)給藥干預(yù)后，小檗胺、中藥組小鼠均有使外周血TNF-α降低的趨勢，其中中藥方能明顯降低小鼠外周血TNF-α水平，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

表5 小鼠外周血TNF-α含量（x± s ，n = 10） pg/mL

3 討論

骨髓是機(jī)體對電離輻射高度敏感的器官之一[7]，電離輻射發(fā)生后，其突出的不良反應(yīng)是骨髓抑制及白細(xì)胞減少[8]。輻射導(dǎo)致骨髓造血功能嚴(yán)重受損，造血細(xì)胞有絲分裂停止，細(xì)胞更新中斷，反映在外周血象中則表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)量迅速下降和血紅蛋白濃度的降低，其中白細(xì)胞對射線高度敏感。故外周血細(xì)胞計數(shù)可反映骨髓的造血功能[9]，白細(xì)胞數(shù)量的改變能夠反映輻射損傷的嚴(yán)重程度[10]。

CD34抗原是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原[11]，陽性表達(dá)于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面[12]，正常人骨髓低密度單個核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞約占1.5%[13]，并隨著骨髓干細(xì)胞的分化成熟而逐漸減少直至消失[114]。小鼠骨髓中CD34+細(xì)胞的比例,可反映骨髓中造血干祖細(xì)胞的數(shù)量[15]。

電離輻射通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯、G2期阻滯、S 期延遲及S/M解偶聯(lián)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程[4]。機(jī)體內(nèi)有一系列的適應(yīng)機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受損傷，多種有害刺激如射線，可以打破氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，促使細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致病理損傷[16]。骨髓中分裂增生能力旺盛的造血干祖細(xì)胞受到輻射后發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，這是機(jī)體對外界刺激的一種保護(hù)性反應(yīng)，此時可提供充足的時間對輻射損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，但損傷嚴(yán)重者通過G1期永久性阻滯或被誘導(dǎo)凋亡而清除掉。

造血干祖細(xì)胞的增殖分化受到體液因子的調(diào)控，負(fù)向調(diào)控的因子對造血干祖細(xì)的增殖分化有不同程度的抑制作用[17]。輻射損傷促進(jìn)了負(fù)調(diào)控因子TNF-α的表達(dá)，使之對造血系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控，抑制造血細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18]。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)作用[19]。有報道顯示，輻射可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）的過度表達(dá)，而TNF-α又可影響骨髓微環(huán)境，誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡[20]。

本研究表明，中藥復(fù)方能顯著升高白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白濃度，同時病理切片顯示出對骨髓損傷的保護(hù)作用，說明中藥復(fù)方能夠有效的防護(hù)電離輻射所致的骨髓損傷。輻射后負(fù)向調(diào)控因子如TNF-α的過度表達(dá)加劇了骨髓抑制，而照射前小鼠灌胃益氣解毒中藥復(fù)方，結(jié)果顯示能夠很好的防護(hù)骨髓，其中的機(jī)制之一可能是通過降低外周血中TNF-α水平對抗其對骨髓造血功能的負(fù)性調(diào)控。中藥復(fù)方對照射后第4天小鼠骨髓的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡影響不明顯，CD34+細(xì)胞百分比也未見統(tǒng)計學(xué)差異，說明在中藥復(fù)方雖然對輻射所致的骨髓損傷有一定的防護(hù)作用，但是照射后第4 天的實(shí)驗結(jié)果還不能支持其防護(hù)機(jī)制是通過延緩骨髓細(xì)胞周期阻滯，降低細(xì)胞凋亡率來實(shí)現(xiàn)的，其中深入的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。