二甲雙胍聯合卡鉑對宮頸癌U14細胞的體內抗腫瘤研究

盛敏佳,赫東蕓,王立巖,唐莊艷,仝曉麗

(吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033)

據2015年全球數據顯示，在發展中國家，宮頸癌位居女性好發腫瘤第四位，僅在中國每年就有13萬新發病例及5萬死亡病例[1,2]。順鉑是宮頸癌一線化療藥物的首選。然而，宮頸癌細胞對化療藥物的耐藥性導致腫瘤的復發及遠處轉移，因此，我們急需解決化療藥物的耐藥性。二甲雙胍是II型糖尿病的一線治療藥物，目前被認為具有潛在的抗腫瘤作用，低劑量的二甲雙胍在乳腺癌中能有效抑制細胞轉化并殺傷腫瘤干細胞，并且二甲雙胍聯合化療藥物阿霉素能夠共同殺傷腫瘤干細胞及腫瘤細胞[3]。在卵巢癌、子宮內膜癌及宮頸癌中二甲雙胍可以作為一種抗癌成分來抑制腫瘤細胞增生，研究顯示其機制為直接激活AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)，之后抑制哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，從而抑制靶細胞內蛋白的合成及增殖[4,5]。本實驗組體外實驗也已證實二甲雙胍能夠通過誘導細胞凋亡及阻滯細胞周期G0/G1期來抑制宮頸癌細胞的增殖，具有抑制腫瘤細胞生長的作用，同時二甲雙胍與卡鉑聯合應用能夠增強卡鉑對宮頸癌細胞的化療敏感性[6]。

為了進一步探討二甲雙胍是否可抑制宮頸癌小鼠移植瘤模型腫瘤的生長，本文通過建立宮頸癌U14細胞小鼠皮下移植瘤模型，探討二甲雙胍聯合卡鉑對小鼠宮頸癌U14細胞的體內抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源及飼養條件6周齡雌性昆明鼠，20±0.5 g，購自吉林大學實驗動物中心，飼養于中國科學院長春應用化學研究所動物房。飼養環境：溫度25℃，濕度40-60%，噪音分貝<60分貝，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。

1.2宮頸癌U14細胞小鼠皮下移植瘤模型的構建吸取U14腹水型瘤源鼠腹腔中的腹水型瘤細胞,稀釋成1.6×106個/ml,于小鼠右側后腿背側皮下接種細胞懸液0.1 ml，接種一周后，對小鼠成瘤情況進行觀察，采用電子游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤直徑在6 mm左右時，認定為小鼠移植瘤模型構建完成。

1.3實驗分組將宮頸癌U14細胞小鼠皮下移植瘤模型進行隨機分組，共分為4組，每組9只小鼠：第一組為生理鹽水腹腔注射對照組，第二組為二甲雙胍腹腔注射組，第三組為卡鉑腹腔注射組，第四組為二甲雙胍聯合卡鉑腹腔注射組。

1.4各組治療方案小鼠皮下移植瘤模型構建完成后，自接種后第8天開始分別給予二甲雙胍、卡鉑、二甲雙胍聯合卡鉑進行干預。腹腔注射二甲雙胍溶液(100/mg/day)，連續給藥18天；卡鉑50 mg/kg，給藥時間1天；對照組小鼠則腹腔注射等量的生理鹽水，給藥時間為18天。

1.5腫瘤體積及小鼠體重測量給藥后每2天用電子游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤的長徑和短徑(mm)，并以此計算腫瘤體積(V=0.52×長徑×短徑2)，同時監測小鼠體重(g)。

1.6病理組織學檢查實驗結束后將小鼠斷髓處死，將四組瘤體固定在10%甲醛中，制備HE染色切片,鏡下觀察各組腫瘤組織細胞形態變化。

1.7統計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，結果以“均數±標準差”表示，根據實驗設計采用t檢驗進行比較；生存分析采用Kaplan-Meier法；P<0.05表示有統計學意義，P<0.01，差異極顯著。

2 結果

2.1宮頸癌U14細胞株小鼠皮下移植瘤體積的影響

實驗周期內，U14實驗結束后，各組腫瘤體積增長率如圖1所示，生理鹽水對照組腫瘤體積增長511.4±24.5%，二甲雙胍組腫瘤體積增長306.4±37.3%，卡鉑組腫瘤體積211.5±9.98%，二甲雙胍聯合卡鉑組腫瘤體積40.4±13.4 mm%。生理鹽水腹腔注射組皮下腫瘤體積增長最快，而二甲雙胍組、卡鉑組腫瘤體積增長與對照組比較緩慢，二甲雙胍聯合卡鉑給藥組能夠顯著抑制腫瘤生長，與二甲雙胍組，卡鉑組及對照組相比，均具有極顯著性差異(P<0.01)。

圖1 各組腫瘤體積增長百分率比較

2.2宮頸癌U14細胞株小鼠體重的影響

如圖2所示，實驗過程中每2日監測小鼠體重，結果顯示實驗周期內，各組小鼠體重均有所增長，但各組間比較無明顯差異，說明二甲雙胍聯合卡鉑腹腔內注射治療宮頸癌U14細胞株荷瘤小鼠時，當給藥劑量后對小鼠無毒性反應。

2.3宮頸癌U14細胞株小鼠皮下移植瘤的組織形態學特征

實驗結束后，將4組小鼠移植瘤瘤體固定在10%甲醛中，制備HE染色切片,觀察各組腫瘤組織細胞形態變化，對照組少見癌細胞凋亡或壞死，呈典型的巨核、異性核；二甲雙胍聯合卡鉑給藥組可見細胞松散，多見局灶性壞死，細胞核深染，呈褐色，另可見細胞核固縮、溶解、碎裂，染色質部分紅染。其余2組癌細胞異型性及細胞核裂解、壞死程度介于對照組和聯合給藥組之間，綜上所述，二甲雙胍聯合卡鉑給藥能夠更好的引起腫瘤組織凋亡和壞死。

圖2 各組荷瘤小鼠體重變化比較

圖3 各組荷瘤小鼠移植瘤HE染色結果

3 討論

宮頸癌是目前女性好發的腫瘤之一，手術、放療及化療常常單獨或聯合用于治療宮頸癌，但生存率仍然不理想。因此，抑制腫瘤侵襲和遷移的重要策略是重新選定藥物同時應著重考慮提高患者的整體生存質量和生活質量[7]。由抗癌藥物和不同作用機制的藥物組成的組合療法可以產生協同效應，且通常比單一療法更有效[8,9]。最近的流行病學研究證實口服二甲雙胍的糖尿病患者其癌癥的發病率及死亡率均降低[10，11]。越來越多的體內、體外試驗也證實了二甲雙胍對于多種癌細胞具有直接的殺傷作用[12]。有研究將二甲雙胍與奈非那韋聯合作用于宮頸癌細胞，結果發現當兩者單獨作用于宮頸癌HeLa,SiHa和 CaSki 細胞株時，其對腫瘤細胞的抑制增殖、誘導凋亡、抑制轉移及侵襲作用均較弱，當聯合應用兩種藥物時，這兩種藥物能夠很好的協同抑制人宮頸癌細胞體外生長和裸鼠體內宮頸癌細胞異種移植，并抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲[13]。

大量證據證實二甲雙胍對婦科腫瘤如卵巢癌等有較好的療效，且能改善內皮功能[14]。然而二甲雙胍對宮頸癌的作用機制卻很復雜，了解這些機制對于充分利用其抗癌潛力至關重要。研究顯示二甲雙胍可以抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的表達，并且能夠對宮頸癌具有化療協同作用，對多種腫瘤也具有直接及間接的抗腫瘤作用[15]。二甲雙胍能夠拮抗促進腫瘤細胞增殖、活動、侵襲和遷移的特定途徑[16-18]。二甲雙胍能夠通過降低胰島素樣生長因子水平，直接激活腺苷單磷酸酶活化蛋白激酶通路，抑制胰島素信號傳導，從而降低腫瘤葡萄糖供應，起到抑制腫瘤生長的作用[19]。二甲雙胍另一種抗腫瘤機制是能夠抑制MALAT1的表達并誘導miR-142-3p的表達，破壞了宮頸癌細胞核中的MALAT1/miR-142-3p海綿體，導致了miR-142-3p釋放到細胞質中，與HMGA2 3′UTR結合，最終抑制了宮頸癌細胞的侵襲及轉移[20]。本實驗組已將二甲雙胍與卡鉑聯合，應用MTT法、AO/EB染色及流式細胞儀對宮頸癌Hela細胞進行了體外試驗研究，結果證實二甲雙胍能夠通過誘導細胞凋亡及細胞周期G0/G1期阻滯來抑制宮頸癌Hela細胞的增殖，同時二甲雙胍與卡鉑聯合作用于宮頸癌Hela細胞，可以增強其體外抑瘤作用[6]。

本實驗將二甲雙胍及卡鉑單獨及聯合作用于宮頸癌荷瘤小鼠，結果證實二甲雙胍聯合卡鉑給藥能夠明顯抑制腫瘤體積生長，且不增加化療藥物毒性反應，對腫瘤的抑制作用顯著優于其他各組。綜上所述，二甲雙胍聯合卡鉑能夠能顯著抑制宮頸癌U14細胞株小鼠皮下移植瘤的生長，二甲雙胍能夠增強卡鉑的化療敏感性。本研究結果為宮頸癌化療以及抑制腫瘤轉移和復發的新藥物治療提供一定的理論依據和實驗基礎。