HMGB1移位和釋放與肝臟缺血再灌注損傷的機制

劉樹雄，何 建

(上海東方肝膽外科醫院 急診科，上海200438)

造成肝臟缺血再灌注損傷后組織出現不可逆性的病理損傷的主要因素即炎癥因子的聯式的反應與瀑布樣富集[1-3]。高遷移率族蛋白1(HMGB-1)屬于晚期炎癥因子，HMGB-1的表達在急性重型肝炎等多種肝臟疾病患者體內異常升高，且HMGB-1的表達還關聯到患者預后。采用人工輸注的方式抑制肝部疾病患者血清的HMGB-1表達，可有效降低肝細胞的凋亡率[4-7]。本研究即探究大鼠發生肝臟缺血再灌注損傷后肝組織中HMGB-1的表達，并分析其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究選取45只1月齡的雄性SD大鼠。購自武漢大學實驗動物中心。

1.2 肝臟缺血再灌注模型的建立及分組

采用隨機數字法，將45例受試大鼠隨機分為三組，每組15只大鼠。術前12 h、術前1 h向HMGB1干預組受試大鼠腹腔輸注兔抗小鼠HMGBI抗體，分別與術前12 h、術前1 h向缺血再灌注組受試大鼠腹腔輸注生理鹽水，假手術組大鼠不采取任何預處理措施。缺血再灌注組及HMGB1干預組大鼠麻醉后，取仰位進行固定，打開腹腔，夾閉其肝門靜脈以及肝動脈，1 h后恢復血流再灌注以制造肝臟缺血再灌注大鼠模型。假手術組大鼠打開腹腔后不夾閉肝門靜脈及肝動脈。

1.3 方法

1.3.1血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)含量 恒溫條件下應用小鼠約70%的肝缺血再灌注模型，缺血再灌注后6 h斷尾取血，將血液樣本置于離心機內以4 000 rpm的轉速離心10 min，分離血清后保存于-80℃冰箱中待測；用自動生化分析儀(BS-300型，邁瑞全)檢測大鼠血清ALT、AST含量。

1.3.2肝組織中細胞凋亡指數 肝細胞凋亡指數采用Annexin V-FITC/EGFP 細胞凋亡測試劑盒(上海翊圣公司)進行測定，采用PBS洗滌正常培養以及誘導凋亡的懸浮細胞2次，加入100 μl Binding Buffer以及10 μl FITC標記的Annexin-V(濃度20μg/mL)，室溫避光條件下靜置30 min后加入5 μl PI(濃度50 μg/mL)，避光條件下反應5 min后加入Binding Buffer 400 μl，采用FAC Scan流式細胞術測定，陰性對照不加Annexin VFITC和PI。

1.3.3肝組織中MPO含量 取大鼠肝組織，采用濾紙將肝組織表面血滲液吸干后將其置于-80℃冰箱中冷凍；取出冷凍的肝組織，將其置于預冷的生理鹽水中進行漂洗，隨后采用濾紙吸干水分，向適量肝組織中加入試劑二混勻，混勻后將0.1 ml試劑三加入0.9 ml組織勻漿中再次混勻，置于37℃水浴中15 min；向勻漿中依次加入試劑四以及顯色劑，置于37℃水浴中30 min；向勻漿中加入試劑七，充分混勻后，置于60℃水浴中10 min；取出，在460 nm波長條件下測定OD值。MPO(U/g)計算公式=(測定管OD值-對照管OD值)/×11.3肝組織量(g)。ELISA試劑盒購自上海廣銳公司。

1.3.4肝組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達測定 HMGB-1mRNA表達采用RT-PCR測定，逆轉錄試劑盒購自Takara公司，10 μl反應體系的反應條件如下：94℃預變性3 min、94℃變性3 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s，循環共計30次。mRNA相對表達量采用紫外分光光度計測定的HMGB-1mRNA吸光度值表示。HMGB1蛋白表達采用ELISA試劑盒檢測：將HMGB-1單抗包被于酶標板，加入試劑盒內抗HMGB-1抗體以及親和素，加顯色底物和終止液，用酶標儀測定450 nm波長下吸光度值，HMGB-1蛋白通過繪制標準曲線計算。

1.3.5ELISA法測定肝組織中炎性因子及氧化應激水平 炎性因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)。氧化應激指標包括超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，ELISA試劑盒購自上海凱博生化試劑有限公司。

1.4 統計學處理

采用SPSS20.0統計軟件(美國IBM公司)；計量資料采用“均數±標準差”表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率(%)表示，比較采用χ2分析；P<0.05代表差異有統計意義。

2 結果

2.1 肝功能指標

缺血再灌注組ALT、AST水平明顯高于假手術組(P<0.05)；HMGB1干預組ALT、AST水平高于假手術組(P<0.05)，見表1。

表1 三組受試大鼠肝功能指標比較

2.2 三組受試大鼠肝組織細胞凋亡指數比較

缺血再灌注組肝組織細胞凋亡指數高于假手術組(P<0.05)；HMGB1干預組高于假手術組(P<0.05)，見表2。

表2 三組受試大鼠肝組織細胞凋亡指數比較

2.3 肝組織中MPO含量

缺血再灌注組肝組織中MPO含量高于假手術組(P<0.05)；HMGB1干預組肝組織MPO含量高于假手術組(P<0.05)，見表3。

表3 三組受試大鼠肝組織中MPO含量比較

2.4 三組受試大鼠肝組織中HMGB1mRNA及蛋白表達比較

缺血再灌注組肝組織HMGB1 mRNA及蛋白表達高于假手術組(P<0.05)；HMGB1干預組肝組織HMGB1 mRNA及蛋白低于缺血再灌注組，但高于假手術組(P<0.05)，見表4。

表4 肝組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達

2.5 肝組織中炎性因子表達

缺血再灌注組炎性因子高于假手術組，HMGB1干預組低于缺血再灌注組、高于假手術組(P<0.05)，見表5。

表5 肝組織中炎性因子表達

2.6 氧化應激水平

大鼠氧化應激水平檢測結果顯示，缺血再灌注組受試大鼠SOD明顯低于假手術組，HMGB1干預組明顯高于缺血再灌注組、低于假手術組，三組間差異具有統計學意義(P<0.05)；缺血再灌注組受試大鼠MDA明顯高于假手術組，HMGB1干預組明顯低于缺血再灌注組、高于假手術組，三組間差異具有統計學意義(P<0.05)；見表6。

表6 氧化應激水平比較

3 討論

肝缺血再灌注損傷屬于病理生理學事件之一，對患者的肝臟功能造成嚴重影響。目前關于肝缺血再灌注損傷的機制尚未完全明確，因此在其預防以及治療方面均無效果顯著的方法。HMGB1屬于HMG蛋白超家族成員之一，是普遍存在的一種DNA結合蛋白[8]。當機體受到刺激時，免疫或非免疫細胞會向胞外環境釋放HMGB1，多種炎癥及免疫性疾病的發病機制可能與這一過程相關。已有學者提出，HMGB1的移位與釋放與肝臟缺血再灌注損傷的進展相關，HMGB1可能是該損傷機制中的一種重要的調控因子[9-11]。本研究中，缺血再灌注組受試大鼠肝組織中HMGB1水平以及細胞凋亡指數均明顯高于假手術組，而術前輸注抗HMGB1抗體的干預組受試大鼠肝組織中HMGB1水平以及細胞凋亡指數則明顯低于缺血再灌注組，但仍高于假手術組，提示在大鼠肝臟缺血再灌注損傷后，肝組織中HMGB1含量明顯上升、細胞凋亡率增加，而建模前腹腔輸注抗HMGB1抗體則可以有效環緩解這一現象，由此可以推斷在肝臟缺血再灌注損傷及修復過程中HMGB1扮演重要角色[12,13]。

本研究采用ELISA法檢測大鼠肝組織中TNF-α、IL-6炎性因子表達發現，缺血再灌注組受試大鼠明顯高于假手術組，HMGB1干預組則明顯低于缺血再灌注組、但仍高于假手術組，提示抗HMGB1抗體改善大鼠肝臟缺血后再灌注損傷可能是通過下調TNF-α及IL-6水平實現。SOD是機體清除氧自由基的主要成分之一， MDA是一種體內氧化應激的終末產物，本文研究發現，缺血再灌注組受試大鼠SOD水平明顯低于假手術組、MDA水平明顯高于假手術組，而采用抗HMGB1抗體干預后，大鼠SOD水平明顯升高、MDA水平明顯降低，提示HMGB1干預降低了肝臟缺血再灌注損傷大鼠的氧化應激程度減輕，其與HMGB1介導的中性粒細胞積聚以及促炎因子趨化相關。

綜上所述，大鼠肝臟缺血再灌注損傷后，HMGBI表達顯著上升，輸注HMGBI抗體可有效改善大鼠肝臟缺血再灌注損傷，其機制可能與下調炎性因子表達、降低炎癥引起的細胞凋亡相關。