烏頭堿在斑馬魚胚胎和幼魚發育過程中的神經毒性作用

王翀昊,王心童,朱 娜

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院 神經外科，北京100050；2.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科；3.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所)

烏頭堿為雙酯類生物堿，具有很強生理活性；藥理學研究表明其具有抗炎、麻醉鎮痛、擴血管降壓、抑制腫瘤生長等藥理作用[1]；尤其在外用鎮痛方面有其獨到之處，是蒙藥常用的制劑之一。但烏頭堿的毒性比較大，0.2 mg即可使人中毒，3-5 mg即可致死[2]；外用藥亦可通過皮膚累積吸收[3]。因此，烏頭堿的毒性研究一直是人們關注的熱點。烏頭堿的心臟毒性目前已被廣泛和系統的研究，但其神經毒性方面的研究較少，大多集中在臨床病例報道和癥狀描述方面，只有少數實驗以胎鼠為模型進行了驗證[4,5]，缺乏低劑量積累造成的慢性毒理研究，也缺乏烏頭堿神經毒性的機制探索。

近年來，人們研究發現斑馬魚作為模式生物進行神經毒性研究具有其他生物不可比擬的優勢：斑馬魚神經形成過程和機制以及對于藥物的反應都與人具有高度相似性；與哺乳動物相比，斑馬魚的繁殖周期短、實驗成本低；斑馬魚胚胎通體透明，可直接應用顯微鏡觀察其神經細胞等。因此斑馬魚作為脊椎動物模型廣泛應用于藥物神經毒性的研究[6-8]。本研究以斑馬魚為實驗模型，動態研究烏頭堿在胚胎及幼魚發育早期的神經毒性，并初步探討烏頭堿神經毒性的可能作用機制，為烏頭堿的安全應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

烏頭堿購于Target Mol公司，純度≥98%，分子式C34H47NO11，母液溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，再以斑馬魚胚胎培養液稀釋至實驗所需濃度，DMSO終濃度≤0．1%。

1.2 斑馬魚飼養和魚卵采集

實驗AB系斑馬魚，魚體長(30±5)(x±s)mm，體質量(0.20±0.05)(x±s)g，取自北京大學生命科學研究院。參照Westerfield的方法養殖并繁殖斑馬魚。光周期14 h/10 h，水溫控制在(28±1)℃，溶解氧不低于4 mg/L，正常喂食，每天2次。成魚雌雄分開飼養。實驗前16 h將親魚(雌雄比例1∶1)放入交配缸，次日晨取隔板使其自然交配。受精后6 h鏡下檢查，確定發育階段并選擇正常受精卵備用。

1.3 游泳行為觀察

將受精后6 h斑馬魚胚胎置于12孔板(20顆/孔)中，每孔分別加入4 ml的0 μM,0.1 μM,0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM 的烏頭堿溶液，每天更換1/2體積相應濃度的烏頭堿溶液至受精后96 h。將直徑為10 cm的培養皿放置在如圖1A所示圓圈的薄板上，在顯微鏡下隨機選擇各濃度組的受精后96 h斑馬魚幼魚，將幼魚放置于圓心位置，用探針輕觸幼魚尾部，選擇每個濃度組幼魚10條，每條觸動20次。記錄在測試周期內幼魚連續游泳時穿越交叉線和內同心圓線的次數。幼魚游泳活力與單位時間內幼魚所游過的距離正相關[9]。

1.4 乙酰膽堿酯酶活測定

顯微鏡下剝離不同濃度烏頭堿作用的斑馬魚脊索，30條/組。加入5倍體積蛋白勻漿液(Tris-Cl 100 mmol/L,NaCl 50 mmol/L,KCl 30 mmol/L,EDTA 2 mmol/L,PMSF 2 mmol/L,1% Triton X-100,pH 7.5)冰上勻漿每組斑馬魚脊索組織，4℃ 800 g離心10 min；取勻漿液上清待測乙酰膽堿酯酶活性。具體參照Ellman的方法[10]。AChE活性單位定義：每毫克組織蛋白在37℃保溫6 min，水解體系中1 μmol 底物為1 個活力單位。按如下公式計算AChE 活力。組織勻漿中AChE 活性(U/mg Pr)=(OD 樣品-OD 對照)/(OD 標準-OD 空白)×1/樣品總蛋白濃度。

1．5 統計學處理實驗數據

2 結果

2.1 烏頭堿抑制幼魚游泳活力

分別以不同濃度的烏頭堿培養液(0 μM,0.1 μM,0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM)于胚胎期(0-4 d)持續給藥，然后換到正常培養液中，觀察幼魚5-8 d的游泳行為。結果發現，隨著烏頭堿濃度的增加，幼魚游泳活力逐漸減弱。如圖1所示，隨著幼魚發育時間的推進，幼魚在5-8天穿越交叉線次數逐漸降低。當烏頭堿濃度為0.1 μM時，幼魚穿越交叉線次數與無藥物組沒有明顯差別，但烏頭堿濃度達到0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM時，幼魚在5-8天穿越交叉線的次數與濃度與對照組相比在各個相應時期均有明顯差別。說明烏頭堿在達到一定濃度時，會抑制斑馬魚幼魚游泳活力。

圖1 不同濃度烏頭堿溶液中斑馬魚穿越交叉線次數 (A)游泳行為檢測分區俯視圖 (B)不同濃度烏頭堿中斑馬魚穿越交叉線次數

2.2 烏頭堿導致幼魚軀干肌發育萎縮

對照幼魚的體肌節內肌纖維排列整齊，兩種肌纖維分化明顯，其中白肌纖維數量占有明顯優勢 (圖2A)。暴露于低劑量(0.1 μM)的烏頭堿的環境中，肌纖維的排列和肌節長度都沒有明顯地改變(圖2B)。烏頭堿濃度達到1 μM,時，幼魚軀干肌節內白肌纖維數量減少，但仍然可以看到分化的紅白肌纖維(圖2C)；但烏頭堿劑量增至100 μM時，肌纖維的分化不再顯著，(圖2D)。在圖2E中，當烏頭堿暴露濃度高于0.1 μM時，軀干肌節的長度(0.5 μM,0.224±0.005 mm；1 μM,0.209±0.003 mm；10 μM,0.179±0.003 mm；100 μM ，0.137±0.004 mm) 明顯短于對照幼魚(0.254±0.006 mm)。

(A)DMSO(B)烏頭堿濃度0.1 μM(C)烏頭堿濃度1 μM(D)烏頭堿濃度100 μM (E)不同烏頭堿濃度導致肌節長度變化統計圖

2.3 烏頭堿導致Rohon-Beard神經元在發育早期的正常凋亡障礙

如圖3相差顯微鏡照片所示，烏頭堿作用于斑馬魚胚胎72 h后，溶劑對照組幼魚體內幾乎觀察不到RB神經元，神經管背側沒有出現胞體巨大的細胞(圖3A)。當暴露于有烏頭堿存在的環境，在幼魚的神經管背側可以看到數量不等的RB細胞，其數量隨著烏頭堿處理劑量增加而上升(圖3B-D)。

2.4 烏頭堿通過抑制乙酰膽堿酯酶活性對斑馬魚胚胎和幼魚產生神經毒性

為了揭示烏頭堿導致的上述兩個組織學異常現象的原因，我們連續檢測了烏頭堿處理后3個發育時間點(24、48、72hpf)實驗幼魚脊索總AChE活性水平(IU/pro)，測量結果匯總于圖4中。結果發現，斑馬魚胚胎暴露于烏頭堿72 h，烏頭堿濃度大于0.5 μM，即可導致孵化后的幼魚體內的AChE活性顯著降低；提示我們烏頭堿可降低乙酰膽堿酯酶活性，抑制Rohon-Beard神經元生理性凋亡，從而對斑馬魚幼魚產生神經毒性。

(A)DMSO (B)烏頭堿濃度0.1 μM (C)烏頭堿濃度1 μM (D)烏頭堿濃度100 μM

圖4 烏頭堿對斑馬魚脊索神經元乙酰膽堿酯酶活性的抑制

3 討論

烏頭堿具抗炎、麻醉鎮痛、擴血管降壓、抑制腫瘤生長等藥理作用，是臨床常見的重要藥物；但其中毒劑量很接近藥用劑量，因此，用藥需謹慎。烏頭堿的神經毒性在體外模型上已有初步研究，但其神經毒性缺乏體內動物實驗研究。國際上常用斑馬魚作為模型檢測藥物潛在的神經毒性效應。本研究選擇模式生物斑馬魚為動物模型研究烏頭堿的神經毒性。結果發現當烏頭堿濃度大于0.5 μM時即可表現出輕微的毒性，具體體現在斑馬魚幼魚游泳活力減弱，肌節發育不良等表型。進一步觀察胚胎發育情況，發現烏頭堿作用于斑馬魚胚胎72 h，即可導致斑馬魚發育時期正常凋亡的初級感覺神經元(Rohon-Beard神經元)凋亡障礙。乙酰膽堿酯酶在RB神經元凋亡中扮演著重要角色[11]，而烏頭堿又是乙酰膽堿酯酶的天然抑制劑[12,13]，那么烏頭堿是否通過抑制乙酰膽堿酯酶活性導致RB神經元凋亡障礙？通過檢測暴露于不同濃度烏頭堿的斑馬魚胚胎脊索乙酰膽堿酯酶活性，發現濃度大于0.5 μM的烏頭堿作用胚胎72 h后即可明顯抑制斑馬魚胚胎發育早期脊索組織中乙酰膽堿酯酶的活性；提示我們烏頭堿可能通過抑制乙酰膽堿酯酶活性對斑馬魚胚胎和幼魚產生神經毒性。對于烏頭堿神經毒性的研究，還需要更多的動物模型進行體內實驗，以便更好的對烏頭堿的臨床用藥進行指導。