TNF-α基因多態性及缺氧對激素誘導性股骨頭壞死的影響分析

薛 亮,白東昱

(延安大學附屬醫院 關節外科,陜西 延安716000)

股骨頭壞死是由多種因素因子的病理過程，涉及到血供的損傷以及骨細胞的壞死，且一般認為本病不可逆，臨床上可分為創傷性股骨頭壞死和非創傷性股骨頭壞死[1]。激素性股骨頭壞死(SONFH)屬于非創傷性股骨頭壞死，通常是由于腎上腺激素的長期和過量使用所致，但其發病機制尚不完全清楚[2]。為了探討腫瘤壞死因子(TNF)-α基因多態性及缺氧對激素誘導性股骨頭壞死的影響，本次研究對我院在2013年1月-2015年1月期間收治的100例激素性股骨頭壞死患者進行了病例對照研究，現將相關內容報道如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源

選取2013年1月-2015年1月期間我院收治的100例激素性股骨頭壞死患者作為病例組，所有患者均依照國際骨循環研究會制定的相關標準[3]被確診為激素性股骨頭壞死。同時選取同期我院體檢的100例健康人群作為對照組。被納入本次研究的所有研究對象均為漢族，其中對照組男性患者64例，女性患者36例；病例組男性患者67例，女性患者33例。本研究經醫院倫理委員會討論會通過，所有患者均知情同意，并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

所有研究對象均被抽取20 ml靜脈血，加EDTA-NA2抗凝劑，并采用淋巴細胞分離液分析有核細胞，然后用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用Primer 5軟件設計氨基酸標記的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針，的引物的5'端都標記有生物素。將探針分別固定到硝酸纖維素膜上，將PCR特異性擴增產物與之雜交，然后將濾膜放入10%的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，用蒸餾水洗滌幾次并在濾紙上干燥，室溫下，放入顯色液中10-15分鐘，藍紫色的斑點被記錄為陽性，經顯色反應后記錄結果。比較兩組患者TNF-α基因型。

rs1800629的引物為： 5’-GAAGTTAGAAGGAAACAGACCACAG-3’，

反向： 5’-TGTGGTCTGTTTCCTTCTAACTTCC-3’，

rs1799964的引物為： 5’-AGAAGATGAAGGAAAAGTCAGGGTC-3’

反向： 5’-GACCCTGACTTTTCCTTCATCTTCT-3’

rs1800630的引物為： 5’-TGTAGCGGCTCTGAGGAATGGGTTA-3’

反向： 5’-CCTGTAACCCATTCCTCAGAGCCGC-3’。

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS19.0進行統計分析。采用χ2檢驗分析Hardy-Weinberg平衡(HWE)和兩組間的環境因素差異，根據兩組間方差是否均衡采用t檢驗或t’檢驗來分析兩組間的年齡差異，SNP和環境因素對SONFH易感性的功能分析采用Logistic回歸分析。以P值<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者基線及人口學特征分析

對激素性股骨頭壞死的危險因素進行分析發現，病例組患者的有缺氧史的比例(67%)明顯高于對照組(42%)，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者激素性股骨頭壞死危險因素比較

2.2 兩組患者TNF-α基因多態性與患病風險關系分析

TNF-α基因多態性包括rs1800629，rs1799964和rs1800630。病例組患者rs1800629的AA基因型比例(17.0%)明顯高于對照組患者(5.0%)，病例組患者rs1800630的AA基因型(33.0%)明顯高于對照組患者(4.0%)。Logistic回歸分析顯示， rs1800629的AA基因型較GG基因型有更高的患激素性股骨頭壞死的風險(OR=3.89(1.32-10.44))；rs1800630的AA基因型較CC基因型有更高的患激素性骨頭壞死的風險(OR=7.72(3.21-29.85))。詳見表2。

表2 兩組患者TNF-α基因多態性比較

2.3 激素性股骨頭壞死患者缺氧史與TNF-α基因變異相關性分析

采用Logistic回歸分析激素性股骨頭壞死患者缺氧史與TNF-α基因變異相關性分析。可以看出，以無缺氧史并且rs1800629未發生突變為對照，無缺氧史但有rs1800629突變的研究對象有更高的患激素性股骨頭壞死風險(OR=2.69(1.24-3.96))；有缺氧史并且有rs1800629突變的研究對象患激素性股骨頭壞死風險最高(OR=5.43(1.50-9.56))。以TNF-α的rs1800630位點未變異并且未經歷過缺氧為對照，可以發現患者TNF-α的rs1800630為變異基因型并經歷了缺氧狀態，那么其患激素性股骨頭壞死風險更高(OR=4.74(1.82-6.83))。詳見表3。

表3 激素性股骨頭壞死患者TNF-α基因變異與缺氧相關性分析

3 討論

約40%的患者在使用糖皮質激素后發生股骨頭不可逆的壞死，甚至早期即可出現股骨頭塌陷[4]，糖皮質激素導致股骨頭壞死的機制尚不完全清楚，相關研究發現超過劑量激素可誘導成骨細胞和骨細胞的細胞凋亡，從而減少骨細胞的數量，導致骨細胞的凋亡壞死，甚至破壞骨結構[5]。近年來，廣泛存在于人體組織上的疾病的遺傳多態性的影響引起關注，并有許多研究涉及SNP和股骨頭壞死相關性[6]。然而，很少有研究著眼于TNF-α的基因多態性和SONFH易感性的關聯。此外，SONFH還受到環境因素的影響，相關研究發現年齡在患者的股骨頭壞死發生中起到了一定作用，有研究發現低氧能增強糖皮質激素誘導的成骨細胞的細胞凋亡[7,8]。

對于激素性股骨頭壞死，多數專家認為主要是引起骨細胞凋亡。TNF-α屬于TNF受體家族，參與細胞凋亡的調節，TNF-α基因作為重要的炎癥因子，被認為與破骨細胞增殖和成熟相關聯。有研究發現TNF-α能夠抑制膠原蛋白，堿性磷酸酶活性和骨鈣素的合成，且TNF-α的多態性也與SONFH發作風險密切相關。本研究也發現TNF-α多態性rs1800629和rs1800630與SONFH發生顯著相關。激素性股骨頭壞死患者與健康對照組比較，具有更高比例的缺氧史。 rs1800629的突變基因型可能會增加其激素性股骨頭壞死的發生風險。如果患者TNF-α多態性rs1800630為變異基因型經歷了缺氧狀態，其SONFH的風險增加4倍以上。有學者認為血流減少可能是激素性股骨頭壞死的病理因素之一[9]。激素可通過引起脂肪代謝障礙，造成相關動脈阻塞，導致股骨頭缺血壞死。此外，糖皮質激素可通過誘導膽固醇沉積，降低組織液流動性和細胞膜通透性，從而造成骨細胞死亡[10]。有學者認為激素性股骨頭壞死屬于股骨頭缺血性壞死[11]，在缺血缺氧情況下，p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)途徑激活，可促進低氧誘導的成骨細胞凋亡。在生理或病理情況下，骨組織和細胞缺氧經常存在，低氧狀態下，激活低氧反應通路，通過誘導低氧誘導因子集聚，隨之激活相關基因，參與調控糖酵解、血管形成和血管擴張等，可引起；成骨細胞和骨細胞中大量NO生成，抑制骨的修復和重建造成，對已受損的骨細胞造成進一步損傷，產生大量凋亡細胞[11,12]。

糖皮質激素抑制成骨細胞的產生，促使成骨細胞及骨細胞凋亡[13]。低氧對骨組織細胞也會產生直接影響。近年來，低氧和糖皮質激素介導的細胞反應之間的相互影響已日益引起人們的關注。有研究發現，低氧可造成機體內糖皮質激素釋放，低氧可上調人近端腎小管上皮細胞糖皮質激素受體，增加糖皮質激素的敏感性[14]。在股骨頭局部微環境中，糖皮質激素和低氧之間相互作用，并對成骨細胞和骨細胞產生影響[15]。本研究是以醫院為基礎的病例對照研究，收集的病例來源單一，且病例數僅為100例，具有一定的局限性，后續研究還需進一步擴大樣本量以及樣本來源，以進一步探討TNF-α基因多態性及缺氧在激素誘導性股骨頭壞死發生過程中可能存在相互作用以及其中的機制。