膀胱癌中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與P53基因表達(dá)相關(guān)性的初探

王秀巖,范海濤,張 明,馮樹(shù)強(qiáng),李然偉

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春130041)

雖然膀胱惡性腫瘤的診斷手段和治療方法在不斷改進(jìn)提高，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然很高。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%-70%[1]。其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段均有賴于新生血管的形成。研究證實(shí)有多種因子參與了實(shí)體腫瘤血管生成的全過(guò)程，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被認(rèn)為是目前已知活性最強(qiáng)，特異性最高的新生血管生成誘導(dǎo)因子。新的研究結(jié)果表明，在很多促進(jìn)VEGF表達(dá)水平上調(diào)的因子中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)起中樞開(kāi)關(guān)的作用[2]。另有報(bào)道稱，VEGF和HIF-1α表達(dá)與P53基因突變存在一定關(guān)系，P53可能參與了腫瘤新生血管生成[3]。但也有報(bào)道認(rèn)為P53與VEGF和HIF-1α表達(dá)無(wú)關(guān)[4]。見(jiàn)于上述因素，特別是有關(guān)腫瘤中VEGF，HIF-1α和P53基因表達(dá)相關(guān)性的研究截至目前鮮有報(bào)道，故本研究初步探索這三種蛋白在膀胱癌患者組織細(xì)胞中的表達(dá)狀況，旨在改善分子靶向藥物治療膀胱癌的療效，從而提高患者的生活質(zhì)量和術(shù)后5年生存率。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析我科2010年1月至2016年12 月收治的196例經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBT)和開(kāi)放術(shù)治療的膀胱癌患者，其中男性152例，女性42例，年齡31-82歲，平均年齡55.7歲。細(xì)胞病理分級(jí)：G1期118例，G2期54例，G3期24例。臨床病理分期：非肌層浸潤(rùn)腫瘤114例，肌層浸潤(rùn)腫瘤82例。

1.2方法和判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)篩選收集的庫(kù)存組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫蠟水化并經(jīng)微波爐法修復(fù)抗原后備用。采用SABC免疫組化法。利用人單克隆抗體[VEGF單抗(Clone14 -12 4,ABCAM,5 μg/ml),HIF-1α單抗(Clone8911 5，R&D system,25 μg/ml)及P53單抗(DO-7,DAKO,1∶5)],即用型HIGH-SABC(免疫試劑盒)具體操作步驟參照VEGF抗體，HIF-1α抗體及P53抗體和即用型HIGH-SABC免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)。PBS代替一抗做陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為瘤細(xì)胞膜或瘤細(xì)胞漿或瘤細(xì)胞核陽(yáng)性染色。Tris緩沖鹽溶液，沖洗3次，每次5 min，然后DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，光鏡觀察。光鏡下見(jiàn) VEGF和HIF-1α胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒而胞核無(wú)著色者為陽(yáng)性(圖1,2)，P53胞核著色而胞漿和胞膜無(wú)著色為陽(yáng)性(圖3)。每一組切片由兩位觀察者各自隨機(jī)選取2個(gè)視野，共約500個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)不少于200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。VEGF，HIF-1α和P53蛋白表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)志為每個(gè)視野的著色細(xì)胞數(shù)分別在20% 左右。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以平均值表示。使用χ2檢驗(yàn)和Fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析對(duì)比，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1膀胱癌患者中VEGF、HIF-1α和P53

表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 在196例膀胱癌患者標(biāo)本的組織細(xì)胞中，VEGF、HIF-1α和 P53 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.5 %,57.2% 和49.3%，其表達(dá)與性別和年齡沒(méi)有相關(guān)性。但與臨床分期和細(xì)胞分級(jí)有密切關(guān)系，即肌層浸潤(rùn)膀胱癌中VEGF、HIF-1α及P53陽(yáng)性表達(dá)率高于非肌層浸潤(rùn)者(P<0.05)，細(xì)胞分化差的中級(jí)別和高級(jí)別中的上述三種基因陽(yáng)性表達(dá)率與細(xì)胞分化好的低級(jí)別比較，其差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

附表1 196例膀胱癌患者中VEGF、HIF-1α和P53表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系

2.2膀胱癌患者中VEGF和HIF-1α表達(dá)情

如表2所示，除腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞外，瘤細(xì)胞中也存在VEGF和HIF-1α陽(yáng)性共表達(dá)現(xiàn)象。以VEGF表達(dá)與否將患者分為兩組，觀察HIF-1α表達(dá)情況。結(jié)果顯示在136例VEGF表達(dá)陽(yáng)性和60例無(wú)表達(dá)的患者中，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為67.1% (90/136)和33.3%(20/60),兩者間的表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

附表2 196例膀胱癌患者中VEGF和HIF-1α表達(dá)之間的關(guān)系

2.3VEGF和HIF-1α與P53表達(dá)的相關(guān)性根據(jù)VEGF表達(dá)與否將患者分為兩組，觀察P53表達(dá)狀況。結(jié)果提示在136例VEGF陽(yáng)性表達(dá)和60例無(wú)表達(dá)的患者中，P53的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.8% (76/136) 和30%(18/ 60)。這表明VEGF和P53間的表達(dá)呈正相關(guān)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同樣以HIF-1α表達(dá)與否將患者分為兩組，觀察P53表達(dá)情況。結(jié)果顯示在110例HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)和86例無(wú)表達(dá)的患者中，P53的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.8%(68/110)和30.2%(28/86)，顯示二者表達(dá)密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

附表3 196例膀胱癌患者中P53表達(dá)與VEGF和HIF-1α表達(dá)之間的關(guān)系

圖1 VEGF主要在細(xì)胞漿表達(dá) 圖2 HIF-1α主要在細(xì)胞漿表達(dá) 圖3 P53主要在細(xì)胞核表達(dá)

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，其發(fā)病率有增高和年青化的趨勢(shì)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2015年對(duì)美國(guó)腫瘤發(fā)病率及死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，膀胱癌占全部腫瘤死亡原因的第6位，5年生存率在50%以下，我國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2016年對(duì)國(guó)人腫瘤發(fā)生率及死亡率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌占所有腫瘤死亡原因的第9位，5年生存率在40%左右。膀胱癌是血管依賴性的，其生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移離不開(kāi)新生血管形成。研究證實(shí)，在腫瘤血管生成過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α起著至關(guān)重要的作用[2,5]。

在目前已知的促血管形成因子中，VEGF被認(rèn)為活性最強(qiáng)，特異性最高。雖然影響VEGF的因素很多，而HIF-1α的作用則最大，有學(xué)者甚至將其稱為VEGF的管家轉(zhuǎn)錄因子[6]。HIF-1α能與VEGF的一個(gè)增強(qiáng)子結(jié)合并啟動(dòng)VEGF轉(zhuǎn)錄，使VEGF表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管生成，加速腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[7]。本研究中我們觀察到在196例膀胱癌患者中，HIF-1α和VEGF共同陽(yáng)性表達(dá)者76例，僅單獨(dú)陽(yáng)性表達(dá)者，HIF-1α14例，VEGF24例，其差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示兩者表達(dá)關(guān)系極為密切。

隨著研究的不斷深入，人們廣泛認(rèn)為以往之所以以VEGF為靶點(diǎn)的抗血管生成治療腫瘤未達(dá)到人們所期待的治療效果是因?yàn)楹雎粤薍IF-1α的信號(hào)轉(zhuǎn)錄作用。不過(guò)，也有近期研究認(rèn)為對(duì)于極其復(fù)雜的腫瘤血管生成來(lái)說(shuō)，它也可能受到一些原癌基因或抑癌基因調(diào)節(jié)的影響。由于野生型P53基因被證實(shí)是最重要的抑癌基因。野生型在正常組織細(xì)胞幾乎不表達(dá)，當(dāng)組織細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，則由野生型演變?yōu)橥蛔冃瓦@種突變型P53在癌組織細(xì)胞高表達(dá)[8,9]。故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了VEGF、HIF-1α和P53這三種基因在膀胱癌中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF和HIF-1α與P53表達(dá)之間存在著不同程度的正相關(guān)性，其相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P53 vs VEGFP<0.01，P53 vs HIF-1αP<0.05)。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF，HIF-1α和P53這三種標(biāo)志物在本組196例膀胱癌患者中均呈現(xiàn)出高表達(dá)率，尤其是肌層浸潤(rùn)和分化差的細(xì)胞其陽(yáng)性表達(dá)率，與非肌層浸潤(rùn)和分化好的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率相比較，兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明突變型P53基因參與了腫瘤組織的新生血管形成從而在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中扮演著不可忽略的角色。同時(shí)檢測(cè)VEGF，HIF-1α和P53蛋白對(duì)了解腫瘤惡性度、預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)后續(xù)隨訪治療更有幫助。因此在選擇分子靶向膀胱癌抗血管生成治療時(shí)，應(yīng)重視雙靶位甚至多靶點(diǎn)的綜合治療策略[10，11]，如此才極有可能提升分子靶向用藥的基因治療膀胱癌的水平，從而為改善膀胱癌患者術(shù)后生活質(zhì)量和提高術(shù)后5年生存率帶來(lái)真正確實(shí)有效的幫助。