改良QuEChERS-UPLC-MS/MS測定雞蛋中6種磺胺類藥物和甲氧芐啶殘留

李虹紅

（梅州市食品藥品監督檢驗所，廣東梅州 514000）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一組合成抗菌藥物，該藥物具有抗菌譜廣、價格低廉、性質穩定等諸多優點。由于SAs在體內代謝時間較長，會引起過敏反應、毒性反應，產生耐藥性，引起“三致”作用等。各國對其有嚴格的限量，美國規定磺胺類最大限量為0.1mg·kg-1；歐盟規定磺胺類藥物總量不可超0.1 mg·kg-1；日本要求磺胺二甲嘧啶和磺胺甲基嘧啶的最大殘留量不得超過0.02 mg·kg-1；而我國對雞蛋中的磺胺類藥物有更為嚴格的限制，即不可在雞蛋中檢測出磺胺類藥物[1-2]。目前，磺胺類化合物殘留檢測分析方法大體可分為毛細管電泳法、生物傳感技術、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等，其中液相色譜-串聯質譜聯用法（LC-MS/MS）是最常用的分析技術，因該方法具有高選擇性和高靈敏度。雖然該檢測方法具有優勢，但樣品制備仍是污染物殘留分析過程中的主要挑戰，從復雜基質中提取和清除基質是抗生素殘留分析中最困難的步驟之一。目前有很多研究報道了各種樣品制備方法如液液萃取、固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）、QuEChERS法，用于磺胺殘留檢測的樣品提取和凈化[3-4]。

QuEChERS是由Anastassiades等于2003年最早提出的應用于農藥殘留檢測的樣品前處理方式，現已被應用于獸藥殘留的檢測工作。樣品經乙腈等萃取劑提取后，經鹽析分離，再經凈化材料凈化，過膜上機分析。相較于其他的檢測技術，QuEChERS方法具有快速、簡單、成本低、有效、可靠及安全的特點[5-7]。

本研究針對QuEChERS方法中的提取方式、鹽析試劑和凈化材料進行優化，以減少基質效應，并從雞蛋中有效提取磺胺分析物。對于方法驗證，在最優的QuEChERS UPLC-MS/MS方法條件下研究方法的線性、LOD、LOQ以及方法精度和準確度，以證明所開發的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法可用于常規雞蛋中磺胺藥物殘留分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：雞蛋（市售）；乙睛、甲醇（色譜純，美國ACS恩科化學）；乙酸、甲酸、氨水（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂、無水氯化銨、無水氯化鈣（分析純，上海國藥集團）；ODS C18（50 μm，60A）、PSA（40～60 μm，60A），天津博納艾杰爾科技有限公司；Z-Sep+（美國Supelco公司）；MWCNTs（0.5～2.0 μm），南京先豐納米科技公司。

試劑：磺胺類藥物標準品甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺 胺 氯 達 嗪（Sulfachlorpyridazine，SCP）、磺 胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxine，SDX）、磺胺-6-甲氧 嘧 啶（Sulfadimethoxine，SDT）、磺 胺 苯 吡 唑（Sulfaphenazole，SPA），農業部環境保護科研監測所。

1.2 儀器與設備

LCMS-8040液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀（配電噴霧離子源ESI）；AUW220 型電子分析天平（島津企業管理有限公司）；Thermo ST16R高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；UC-7100S型數控超聲波清洗器（美瑞泰克科技有限公司）；旋渦混勻器 S25（德國 IKA）；Milli Q超純水系統（美國Millipore公司）；全自動氮吹濃縮儀-60（睿科儀器有限公司）；色譜柱Chromolith RP-18（德國默克）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Chromolith RP-18（100 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B，1～14 min，10%～70% B，14.0～15.1 min，10% B，流速：0.4 m·min-1；進樣量：10 μL。

1.3.2 質譜條件

采用電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監測掃描模式；離子噴霧電壓：4.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L·min-1；干燥氣：氮氣15 L·min-1；碰撞氣：氬氣。

1.3.3 樣品前處理

稱取5 g均質后的雞蛋于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入15 mL的1%乙腈乙酸溶液（乙腈∶水∶乙酸為80∶19∶1），充分渦旋混勻后，超聲提取10 min，然后加入鹽析劑（6 g NH4Cl、1 g NaCl），渦旋混合1 min，8 000 r·min-1，低溫離心5 min，準確吸取上清液1.5 mL加入到分散固相萃取-吸附劑中（50 mg Z-Sep+、50 mg PSA、200 mg NH4Cl），渦旋1 min，5 000 r·min-1離心5 min，取上清氮氣吹干，用1 mL 0.1% 甲酸甲醇-水溶液，過0.22 μm濾膜，上機分析。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

磺胺類藥物因含有伯氨基和磺酰胺基而呈酸堿兩性，由于氨基容易獲得正離子形成季鐵鹽結構，因此可以選用ESI+作為離子源進行質譜監測方法學研究，依次將6種磺胺類藥物和甲氧芐啶的標準溶液直接注入質譜檢測儀器中，得到一級質譜掃描結果，7種化合物質子化后形成291.15、271.00、281.00、284.90、311.00、315.00和256.10的母離子，將這些離子峰作為前體離子進行二級掃描，可得到二級質譜信息，選取響應高、干擾小的兩對離子分別作為定量離子和定性離子，優化后的質譜參數見表1。

表1 6種磺胺類藥物和甲氧芐啶質譜參數

2.2 提取方法優化

2.2.1 不同提取方式

本試驗考察了超聲、振蕩、渦旋不同提取方式對提取效率的影響，結果見圖1。結果表明渦旋10 min時磺胺甲噻二唑和磺胺氯噠嗪回收率低，僅為51.4%和55.0%。對樣品進行振蕩10 min，6種磺胺類藥物和甲氧芐啶的回收率較好，在68.4%～117.0%。

圖1 不同提取方式的回收率

2.2.2 鹽析劑優化

本試驗比較了MgSO4、CaCl2、NH4Cl 3種鹽析試劑，試驗結果如圖2所示。使用無水硫酸鎂和無水氯化鈣的樣品回收率低，而采用無水氯化銨回收率在47.4%～117.0%，回收率較好。此外，MgSO4作為鹽析劑有一個缺點，即在用LCMS分析樣品時，樣品中MgSO4會以固體形式沉積在MS離子源的表面上，并且可能在分析器中沉積，導致儀器性能損壞，從而增加儀器維護成本。銨鹽在離子源溫度下會分解，以氣體形式揮發，因此不會產生該問題。此外，NH4Cl可以增強分析物離子化效率，故選用無水氯化銨作為鹽析劑。

圖2 不同鹽析劑的回收率

2.2.3 凈化材料優化

試驗考察了以Z-Sep+-MWCNT、Z-Sep+-PSA、Z-Sep+-C18和MWCNT-PSA的組合對樣品的凈化效果，對樣品進行加標回收試驗，結果見圖3。Z-Sep+-PSA的組合方式6種磺胺和甲氧芐啶的回收率最好，在81.0%～123.0%，表明該組合能夠顯著降低基質效應，氧化鋯包覆硅膠和碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+）是新型固相吸附劑，含有二氧化鋯過渡金屬氧化物，具有路易斯酸-堿的特性，它對脂類化合物如甘油酯和磷脂具有很強的吸附力，能夠很好地凈化樣品，故采用Z-Sep+-PSA的組合作為凈化劑。

圖3 復合凈化材料的回收率

3 方法驗證

3.1 線性范圍及靈敏度

將目標化合物用雞蛋空白基質配制成系列濃度混合標準工作液，以濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明在10～250 μg·L-1，6種磺胺類藥物和甲氧芐啶色譜峰面積與濃度呈較好相關性，相關系數均大于0.99，結果顯示該方法的檢出限為5 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1。

3.2 準確度與精確度

按空白加標回收試驗對方法進行評價，由表2可知，雞蛋樣品中6種磺胺類藥物以及甲氧芐啶在10～150 μg·L-1添加水平內平均回收率在60.7%～119.0%，批間的相對標準偏差在0.50%～14.00%，方法較好的重現性和準確度。

表2 雞蛋中6種磺胺類藥物和甲氧芐啶回收率及相對標準偏差

4 結論

本論文通過對提取方式、吸附劑的種類、鹽析劑的種類進行優化，建立了雞蛋種6種磺胺類藥物和甲氧芐啶的QuEChERS超高效液相色譜串聯質譜的檢測方法，并進行了方法學評價，該方法操作簡單，快速，可大大減少溶劑的使用量；方法穩定性好，靈敏度高，可大批量檢測雞蛋中6種磺胺類藥物和甲氧芐啶的殘留。