山楂葉總黃酮對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟FXR/SREBP-1c表達的影響*

陸永娟 陳芝蕓 何蓓暉# 嚴茂祥

1 浙江省嘉善縣第一人民醫院 浙江 嘉善 314100 2 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是無過量飲酒史、以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，是臨床常見的慢性肝病之一[1]。NAFLD的發病機制尚未完全闡明，肝臟脂質沉積是其發病的基礎。近來研究發現，膽汁淤積、胰島素抵抗、游離脂肪酸增多、氧化應激與脂質過氧化等代謝異常可以導致NAFLD的發生、發展，法尼酯衍生物受體（FXR）可以調節膽汁酸、糖、脂的代謝，可能參與NAFLD的發生發展。山楂葉總黃酮（TFHL）具有抗脂質過氧化、抑制或清除氧自由基、調節血脂、改善肝微循環及抗炎等作用。項目組前期研究發現，TFHL能明顯改善高脂誘導的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠肝臟脂質代謝紊亂，抗氧化應激，抑制炎性細胞因子的分泌等作用[2-3]。為進一步探討TFHL的作用機制，本研究觀察其對NAFLD模型大鼠肝組織FXR/固醇調節元件結合蛋白（SREBP-1c）通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物：雄性SD大鼠40只，體重170±10g，SPF級，上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 主要藥品與試劑：TFHL(Lot：#20111211)，總黃酮含量＞95%，由山西康立生藥業有限公司提供；總RNA提取試劑盒（Cat：KD10111101-G）由愛思進生物技術（杭州）有限公司提供；cDNA合成試劑盒（Cat：BK1401）和熒光定量PCR試劑盒（Cat：BKA3206）由寶生物工程(大連)有限公司提供；引物由寶生物工程（大連）有限公司設計并合成，FXR上游引物：5’-AAGTGACCTCCCGACCA AGA-3’,下游引物：5’-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3’,擴增片段107b；小異二聚體伴侶分子（SHP）上游引物：5’-TGCCTGGAGTCTTTCTGGAG-3’,下游引物：5’-ATGTTCTTGAGGGTGGAAGC-3’,擴 增 片 段227bp；SREBP-1c上游引物：5’-GCTTCTCTGGGCTCC TCTCT-3’，下游引物：5’-GCACTGGCTCCTCTTTGA TT-3’,擴增片段154bp；脂肪合成酶(FAS)上游引物：5’-AGTGGGAAGACCCTGACTCC-3’,下游引物：5’-ATAGACGCCCTGGAAATGAG-3’，擴增片段 152bp；β-actin上游引物：5’-TGTTGCCCTAGACTTCTT CGAGCA-3’,下游引物：5’-CCATACCCAGGAAGGAAG GCT-3’,擴增片段112bp。蛋白抽提試劑盒（Cat：P1250）由北京普利萊基因技術有限公司提供；PotentECLKit（Cat：P1425）由聯科生物技術有限公司提供；FXR兔抗多克隆抗體H-130(sc-13063)和SREBP-1c兔抗多克隆抗體K-10(sc-367)由美國SantaCruz公司提供；FAS兔抗多克隆抗體c20G5(#3180S)由美國CellSignaling公司提供。

1.3 主要實驗設備：AB17900PCR擴增儀（美國ABI公司），多功能酶標儀（美國Thermo公司），LEECARM2025病理切片機（德國Leica公司），日立7020全自動生化分析儀（日本高新技術株式會社），OSE-Y10G電動組織研磨器（天根生化科技有限公司），Mini-PROTEANTetra（美國BioRad公司），FCE型ProteinSimple化學發光成像系統（上海百賽生物技術有限公司）。

1.4 實驗方法：大鼠隨機分為正常組、模型組、TFHL高、中、低劑量組共5組，每組8只。正常組予標準飼料喂養，其他4組每天予高脂飼料（在82.5%標準飼料基礎上添加10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉和5%蛋黃粉）連續喂養12周，同時從造模第5周起TFHL高、中、低劑量組每日分別灌服160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg的TFHL，正常組和模型組以等量的蒸餾水灌胃，均連續灌胃8周。實驗第12周末，空腹麻醉下腹腔靜脈采血，檢測甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平；并收集肝臟標本，肝右葉部分組織在10%中性甲醛中固定用于病理觀察。部分以生理鹽水制成10%肝組織勻漿，再以異丙醇提取、氧化鋁吸附后，分別采用磷脂-乙酰丙酮顯色法測定TG含量，高鐵-硫酸顯色法測定CHOL含量。部分肝組織提取總RNA后再合成cDNA，Realtime-PCR檢測肝組織中FXR、SHP、SREBP-1c、FAS的mRNA表達，以β-actin為內參，相對表達量（2-△△Ct）來表示目的基因mRNA的表達水平。部分肝組織提取蛋白后用WesternBlot檢測肝組織中FXR、SREBP-1c、FAS的蛋白表達。化學發光成像系統曝光得到蛋白條帶圖，用Quantityone軟件分析灰度值，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相對表達量代表目的蛋白的表達水平。

1.5 統計學處理：采用SPSS17.0軟件，計量資料均以均數±標準差（±s)表示。多組樣本間的比較釆用單因素方差分析(one-wayANOVA)，各組之間兩兩比較，若方差齊性時采用LSD檢驗，若方差不齊性時采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TFHL對NAFLD大鼠肝組織CHOL、TG水平的影響：

NAFLD模型組大鼠肝臟TG、CHOL水平較正常組顯著增高（P＜0.05,P＜0.01）；TFHL各劑量組大鼠肝臟TG含量較模型組明顯減少（P＜0.05），TFHL高、中劑量組大鼠肝臟CHOL含量較模型組明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST、CHOL和TG水平比較：詳見表1。

表1 山楂葉總黃酮對NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影響(±s，U/L)

表1 山楂葉總黃酮對NAFLD大鼠血清ALT、AST、CHOL和TG水平的影響(±s，U/L)

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

0.69±0.14 0.59±0.15 0.61±0.06 0.62±0.11 0.59±0.07正常組模型組TFHL低劑量組TFHL中劑量組TFHL高劑量組8 8 8 8 8 36.88±7.04 183.00±71.51*104.13±29.44△97.25±40.65△83.00±14.16△94.13±11.57 284.50±36.73*206.13±44.86△183.38±58.39△174.38±19.11△1.28±0.39 1.58±0.26*1.53±0.27 1.47±0.20 1.40±0.18

2.3 各組肝組織病理變化：光鏡下觀察，正常組肝小葉完整，肝細胞排列整齊，未見肝實質細胞病變，中央靜脈和匯管區結構正常。模型組肝小葉輪廓不清，肝細胞腫大，胞漿疏松，富含脂肪粒，出現重度脂肪變、炎細胞浸潤、小葉內散在壞死灶和部分肝細胞氣球樣變等NAFLD的病理改變；經TFHL治療后肝細胞腫大減輕，肝細胞脂肪沉積減少，小葉內壞死灶和氣球樣變減輕。見圖1、圖2。

2.4 TFHL對 NAFLD大鼠肝組織 FXR、SREBP-1c、FAS、SHPmRNA表達的影響：NAFLD模型組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA水平較正常組顯著下降（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA水平較模型組明顯增加（P＜0.05）；各劑量組大鼠肝組織FXR、SHPmRNA都低于正常組水平。模型組大鼠肝組織SREBP-1c、FAS mRNA水平較正常組顯著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織SREBP-1cmRNA水平較模型組明顯下降（P＜0.05）。TFHL高、中劑量組大鼠肝組織FAS mRNA水平較模型組明顯下降（P＜0.05），但各劑量組大鼠肝組織SREBP-1c、FASmRNA都高于正常組水平。見圖3。

圖1 各組大鼠肝組織脂肪沉積的變化（油紅O×400）

圖2 各組大鼠肝臟組織病理的變化（HE×400）

圖3 TFHL對NAFLD大鼠肝組織FXR、SHP、SREBP-1、FAS基因mRNA表達的影響(n=8)

2.5 TFHL對NAFLD大鼠肝組織FXR、SREBP-1c、FAS蛋白表達的影響：NAFLD模型組大鼠肝組織FXR蛋白含量較正常組顯著減少（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FXR蛋白含量較模型組明顯增加（P＜0.01），但都低于正常組水平。模型組大鼠肝組織SREBP-1c蛋白含量較正常組顯著增加（P＜0.01）；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織SREBP-1c蛋白含量較模型組明顯減少（P＜0.05），但都高于正常組水平。模型組大鼠肝組織FAS蛋白含量較正常組有增加趨勢；TFHL高、中、低劑量組大鼠肝組織FAS蛋白含量較模型組有減少趨勢，但均無統計學差異（P＞0.05）。見圖4。

圖4 TFHL對NAFLD大鼠肝組織FXR、SREBP-1c、FAS蛋白水平表達的影響(n=8）

3 討論

隨著人民生活水平的提高，NAFLD的發病率也在逐漸升高。NAFLD與糖尿病、心腦血管疾病密切相關，被認為是代謝綜合征在肝臟的表現[4-5]。而FXR可以調節膽汁酸、糖、脂的代謝。FXR是配體激活的轉錄因子，通過調節靶基因的表達調控膽汁酸、脂質和糖的代謝[6]。在肝臟，FXR通過誘導SHP的表達，下調膽汁酸合成途徑中的關鍵酶膽固醇-7α-羥化酶（CYP7A1），從而控制膽固醇轉變為膽汁酸[7-8]。同時，FXR通過SHP下調SREBP-1c的表達，SREBP-1c可調節相關成脂基因的水平，包括脂肪合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧基酶等，從而實現FXR對肝臟甘油三酯水平的調控[9]。FXR還能調節磷脂轉移蛋白的表達，加速磷脂和膽固醇從富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白（HDL）轉運；上調肝細胞膜上的清道夫受體B，從而增加HDL介導的膽固醇逆轉運。因此，激活FXR就能發揮抑制膽汁酸的合成、降低甘油三酯等多種藥理活性[10]。對于NAFLD的治療，近年來的臨床報道顯示中醫藥的療效值得肯定，如桂祖全等[11]采用健脾化痰活血法為主治療非酒精性脂肪性肝病肝郁脾虛證68例，總有效率90.16%，臨床療效良好。TFHL在臨床上主要用于降血脂、降血糖、改善脂肪肝、抗心絞痛、抗腫瘤等多種疾病的防治方面。有研究表明，TFHL作為藥用植物山楂葉的提取物，可以調節NAFLD/NASH大鼠脂質代謝紊亂，調控Nrf2及相關因子的表達，緩解NAFLD/NASH大鼠的氧化應激，減少脂質過氧化，增強機體抗氧化能力，減少細胞因子對肝細胞的損傷等[12]。

本實驗模型組肝組織出現典型的NAFLD病理表現，血清和肝組織TG、CHOL含量增加，血清ALT、AST等水平增高，同時大鼠肝組織FXR、SHP表達顯著下降，而SREBP-1c、FAS表達則明顯增加，表明長期高脂飲食可導致大鼠肝組織FXR的表達下降，SHP水平受到抑制，進一步促進SREBP-1c、FAS的表達，影響肝臟脂質代謝的平衡，TG、CHOL等在肝臟沉積，肝酶水平升高，提示肝臟FXR表達降低可能是脂肪肝形成的重要機制，FXR-SHPSREBP-1c-FAS通路參與高脂誘導的NAFLD的發生發展。應用TFHL干預后，大鼠肝組織FXR、SHP表達明顯增加，而SREBP-1c、FAS表達顯著減少，同時TG、CHOL含量和血清ALT、AST水平顯著下降，表明TFHL可能通過增加FXR的表達，誘導SHP，抑制SREBP-1c、FAS的過表達，從而改善肝臟脂質代謝和肝功能紊亂，防止NAFLD的進展。研究提示，TFHL可能是通過調控FXR與SREBP-1c通路，改善肝臟脂質代謝紊亂發揮防治NAFLD的作用。