清熱養陰丹抑制大鼠口腔潰瘍的發生與腸道菌群改善的關系研究*

陳夏涼 袁 曉 夏濤濤

1 浙江大學醫學院附屬第一醫院 浙江 杭州 310003 2 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006 3 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

筆者在臨床治療中采用清熱為主，佐以養陰作為治療大法，運用以“清熱養陰丹”為基礎方的清熱養陰法治療口腔潰瘍，取得較好的臨床療效。很多研究發現中藥比如黃連、靈芝、麥冬等可以直接與腸道菌群相互作用，改善腸道微生態結構和多樣性，發揮對機體的代謝調控作用[1-3]。因此，筆者推測清熱養陰丹具有直接調控腸道菌群的作用，這可能是清熱養陰丹治療口腔潰瘍的重要原因之一。故用實驗研究加以驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：60只SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g。清熱養陰丹藥物(生地、生石膏各30g，玄參24g，貝母、麥冬各15g，白芍、丹皮、梔子各12g，黃連、甘草各9g，山豆根6g，加10倍量水浸泡30分鐘后，煎煮

1小時，提取2次，過濾，濃縮至1g/ml密度的濃縮液)。

1.2 實驗設備：高速離心機（德國艾本德公司），核酸電泳儀器（美國伯樂公司），超聲粉碎機（美國SONICS公司），超低溫冰箱（美國賽默飛公司）。

1.3 實驗方法：分述如下。

1.3.1 動物分組：隨機取40只，分5組，即正常組、模型組、清熱養陰丹治療高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組8只。剩余20只用于動物造模。所有大鼠同室分籠飼養，自然光照，自由飲水進食，飼養溫度18～24℃，相對濕度50%～60%，飼養1周適應實驗室環境后開始進行實驗。

1.3.2 動物模型制備：選用剩余的SD大鼠20只，二氧化碳處死，無菌條件下取口腔黏膜組織置超聲粉碎機磨成糊狀，取弗氏完全佐劑與口腔黏膜懸液按1∶1比例，在研磨時順同一方向逐滴加入黏膜抗原(1h加完)，加完后再研磨20rain以上，直至變為乳狀(即放置后不分層)為止。在SD大鼠脊柱兩側皮內注射上述組織乳化劑，每只注射2點，每點0.1ml。間隔2周注射1次，共注射5次。由口腔專業人員觀察大鼠口腔黏膜確認出現典型潰瘍病變，即為口腔潰瘍大鼠模型。

1.3.3 給藥劑量及方法：模型建立2小時后，各組開始灌胃給藥，每天1次，連續2周。清熱養陰丹治療高、中、低劑量組，根據預實驗結果，按大鼠體重，分別以濃縮液6g/（kg·d）、3g/（kg·d）、1.5g/（kg·d）計算并稱取所需劑量濃縮液，溶于生理鹽水，制成2ml混懸液灌胃；正常組和模型組以2ml生理鹽水灌胃。期間各組大鼠均以普通無菌飼料喂養。

1.3.4 腸道菌群測定：糞便收集：于藥物治療2周后，以無菌方法收集大鼠糞便。將每只大鼠糞便分別放入滅菌EP管，立即放入-80℃保存。菌群DNA提取：稱取0.2g大鼠便樣，放入2ml無菌磁珠管中，采用酚氯仿異戊醇抽提法提取糞便樣品微生物總DNA。然后采用2次PCR擴增16SrDNAV3區，以DNA為模板，采用Touchdown-PCR進行第1次擴增，再以第1次PCR產物為模板進行Reconditioning-PCR，二代測序技術檢測腸道菌群變化。

2 結果

2.1 不同劑量清熱養陰丹對大鼠口腔潰瘍的作用：在構建模型過程中當注射黏膜抗原的第2次（共5次）時，就發現大鼠口腔內有不同程度的充血，第3次注射后1周大鼠即開始出現口腔潰瘍。中藥干預之后，發現中、高劑量的清熱養陰丹可顯著延長大鼠口腔潰瘍的復發間隔時間。所有劑量都可以顯著減少口腔潰瘍的數量和面積大小。高劑量可顯著減少潰瘍持續的時間。見表1。

2.2 清熱養陰丹對腸道菌群的影響：稀釋曲線和Chao數據結果表明，筆者的測序深度足夠覆蓋了所有的菌群，測序結果有效(圖1A，B)。Chao數據表明模型組即口腔潰瘍的大鼠腸道菌群的菌群多樣性顯著低于正常對照組的大鼠。清熱養陰丹干預的低劑量和中劑量組可以提高菌群的多樣性，然而高劑量組并沒有增加腸道菌群的多樣性。β多樣性分析結果顯示高劑量組菌群與模型組菌群差異性最大，表明高劑量組對口腔潰瘍大鼠的腸道菌群影響最大(圖1C)。通過深入的數據分析發現，清熱養陰丹干預后腸道菌群在不同水平上發生了變化。尤其是目水平上的Bacillales（圖1D）、科水平的Rikenellaceae(圖1E)和屬水平上的RC9-gut-group、Alistipes、Dorea、Gemella、hydrogenoanaerobacterium和Bamesiella的菌群的改變與口腔潰瘍模型組呈顯著發生密切相關。見表2。其中RC9_gut_group，在造模組中豐度增加，給藥后豐度降回正常比例，并且隨著劑量增加，這種恢復的幅度越大。

表1 不同劑量清熱養陰丹對大鼠口腔潰瘍的作用

圖1 清熱養陰丹干預后腸道菌群變化情況

表2 造模和用藥兩種處理都改變且相反的階元

3 討論

中醫學認為，口腔潰瘍屬于復發性“口瘡”范疇，其病因病機以“火”為主，其中脾胃伏火較為常見[4]。由于該病遷延反復，病久傷陰耗氣，氣陰損傷是本病遷延難愈、極易復發的內在原因。筆者前期臨床病例診治已經發現清熱養陰丹對口腔潰瘍的療效顯著優于普通激素，遂希望通過動物實驗初步探究清熱養陰丹抑制口腔潰瘍發生的作用機制。通過構建口腔潰瘍大鼠模型以及給予不同劑量的清熱養陰丹，筆者發現清熱養陰丹對大鼠口腔潰瘍的療效是呈劑量依賴性的。另外，通過腸道菌群的高通量測序分析研究發現清熱養陰丹可在不同水平上改變腸道菌群的豐度，尤其是可以逆轉模型組中改變的菌群，比如Bacillales和Rikenellaceae等（圖1D、E）。綜上，結果表明清熱養陰丹具有改善口腔潰瘍大鼠的腸道菌群的紊亂，這一作用可能與其抑制口腔潰瘍的治療作用密切相關。