響應面法優化白刺花中總氨基酸的提取工藝研究

蘭慧 陽敬

【摘 要】 目的：優化白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝。方法：采用響應面分析法，以總氨基酸提取率為評價指標，在考察單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度、加液量、提取溫度和提取時間為自變量，利用Design-Expert軟件分析優化出白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝條件。結果：優化所得白刺花中總氨基酸的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為58%，加液量為21倍，提取溫度為69℃，提取時間為131 min。結論：響應面優化所得到的最佳提取工藝準確、穩定，是提取白刺花中總氨基酸的可行方法。

【關鍵詞】 白刺花；總氨基酸；提取工藝；響應面法

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）13-0018-07

Abstract：Objective Optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Methods Response surface models was used to optimize the extraction technology of total amino acid from Sophora viciifolia hance.The total amino acid were extracted using ultrasonic assisted ethanol extraction.On the basis of single factor， the concentration of ethanol， the amount of liquid added， the extraction temperature and the extraction time were the independentvariables.Design-Expert response surface methodology was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of total amino acid from Sophora viciifolia hance.Results Total amino acid from Sophora viciifolia hance of optimum extraction conditions were as follows，58% of the ethanol concentration，21 times of the amount of liquid added，extraction temperature of 69℃，extraction time 131min. Conclusion The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total amino acid from Sophora viciifolia hance.

Keywords：Sophora Viciifolia Hance；Total Amino Acid；Extraction Process；Response Surface Methodology

白刺花又名苦豆花、狼牙刺，在南方各地均有大量分布[1]，其花為漢族民間及少數民族習用，在民間有廣泛的用藥基礎和豐富的藥物資源[2]，同時也是藥食兩用之品[3]。白刺花有清熱利咽、涼血消腫等作用，主治咽喉腫痛、便血、肺熱咳嗽、痢疾、淋證、水腫、衄血、尿血等；花有清熱解暑作用，用于暑熱煩渴作用[4]。此外白刺花還含有大量的營養成分，如多種氨基酸等[5]。基于白刺花良好的藥食兩用用價值，筆者欲將野生白刺花開發成為保健速溶茶，現通過實驗研究，優化出白刺花中總氨基酸的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開發提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見分光光度計（翱藝儀器有限公司）；ML204分析天平（上海亞榮儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）；HH-4 型恒溫水浴鍋（常州潤華電器有限公司）；DLF-18型流水式中藥粉碎機（溫州頂歷醫療器械有限公司）；RE-3000A 型旋轉蒸發器（上海亞榮儀器有限公司）。

1.2 材料 甘氨酸對照品（分析純，批號：130518，中國新型化工試劑研究所）；苯駢戊三酮（茚三酮，分析純，批號：20110414）；磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.8，實驗室配制）；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；所用到的其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 茚三酮溶液的制備 精密稱取茚三酮約0.5g 置于25 mL 量瓶中，加適量無水乙醇溶解后定容成2%的茚三酮溶液，冰箱冷藏備用。

2.1.2 對照品溶液的制備[6-7] 精密稱取干燥至恒重的甘氨酸對照品5.000 mg置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解后，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升標準品溶液含甘氨酸0.1 mg）。

2.1.3 測定波長的選擇[8] 精密量取對照品溶液2 mL，置10 mL 量瓶中，加入茚三酮溶液1 mL，再加入磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）2 mL，搖勻，水浴鍋上加熱15 min，冷卻，用蒸餾水稀釋至刻度，以空白試劑作參照，于波長400～600 nm范圍內掃描，569 nm波長處有一最大吸收峰，故選擇569 nm為測定波長。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密移取對照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于 10 mL 量瓶中，按“2.1.3”項下方法顯色后，選擇569 nm波長，用空白試劑做參照，測定6種溶液的吸光度值。以濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，得線性回歸方程Y=76.243X-0.0041，R2=0.9998，對照品溶液濃度與吸光度在0.002～0.012 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.1.5 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過60目篩，取粗粉過的白刺花5 g，按實驗設定的條件進行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容至100 ml，即得供試品溶液。

2.1.6 樣品中總氨基酸的含量測定 精密量取2 ml供試品溶液置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”項方法測定吸光度，計算總氨基酸提取率。

總氨基酸的提取率（%）=C×V1×V3×100V2×m

式中：C 為提取總氨基酸的質量濃度，mg/mL；V1為測量液定容體積，10 mL；V2為測量時量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100mL；m為稱取樣品的質量，5000 mg。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 分別精密移取對照品溶液2mL和供試品溶液2 mL，分別于569 nm波長處以空白溶劑為對照，按2.1.3項方法測定吸光度（n=6），結果對照品溶液吸光度的RSD=0.16% ，供試品溶液的RSD=0.23%，表明該試驗方法精密度良好 。

2.2.2 穩定性試驗 精密移取供試品溶液2 mL，按“2.1.3”項方法，分別于 0、30、60、90、120、150、180測定吸光度，結果樣品溶液顯色后180min內吸光度的RSD=1.37% ，表明供試品溶液顯色穩定。

2.2.3 重復性試驗 取同一批次藥材，按“2.1.5”項下方法制備供試品溶液，精密移取該供試品溶液2 mL，按2.1.3項下方法測定各供試品溶液的吸光度（n=6），并計算出各供試品溶液中總氨基酸的含量，其RSD=0.19%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 取已知含量的白刺花藥材粗粉5 g，精密稱定，平行 6份，按2.1.5項下方法制備供試品溶液，精密量取各供試品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，在各容量瓶中分別加入1、2、3、4、5、6 mL的甘氨酸標準品溶液（甘氨酸標準品溶度為0.1 mg/mL），按2.1.3項下方法測定各供試品溶液的吸光度，計算各供試品溶液中總氨基酸的含量，并計算各供試品溶液中總氨基酸的回收率，結果平均回收率為99.91%，RSD=0.72%，表明該試驗方法回收率良好。

2.3 單因素考察

2.3.1 加液量對白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時的乙醇濃度為60% ，時間為1.5h（90min），溫度為80℃ 等試驗因素，考察加液量為5倍、10倍、15倍、20倍、25倍情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖2得知，白刺花中總氨基酸的提取率隨加液量倍數的增大而增高，但加液量為20倍與加液量25倍比較，總氨基酸的提取率雖然有所提高，但提高值不大，從生產角度出發，加液量到25倍，意義不大。

2.3.2 提取時間對白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時的加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，溫度為 80 ℃等試驗因素，考察時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h情況下所提取的總氨基酸的變化。由圖3得知，白刺花中總氨基酸的提取率在提取時間為2 h時最高，此時提取時間繼續延長，提取率反而下降，故提取時間為2h時對白刺花中總氨基酸的提取較為理想。圖中也可反應出提取時間過長，白刺花中氨基酸成分會被破壞。

2.3.3 乙醇濃度對白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時的加液量為20倍，時間為2 h，溫度為80 ℃，考察乙醇濃度分別為40%乙醇 、50%乙醇 、60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖4得知，在乙醇濃度為60%以后，總氨基酸的提取率在呈下降趨勢，即當乙醇濃度為60%時，總氨基酸的提取率達到最高。

2.3.4 提取溫度對白刺花中總氨基酸提取率的影響 固定白刺花中總氨基酸提取時加液量為20倍，時間2 h，乙醇濃度為60%，考查溫度分別為40、50、60、70、80、90℃情況下所提取的總氨基酸的變化。從圖5得知，隨著溫度升高，白刺花中氨基酸提取率在增高，當溫度達到70 ℃ 時，白刺花中總氨基酸提取率達到最高。

2.4 響應面法優化白刺花中總氨基酸提取工藝 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度（C） 和提取時間（D）為考察因素，利用 Design-Expert8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件對白刺花中總氨基酸提取條件進行優化。以白刺花總氨基酸提取率為響應值，進行響應面分析試驗[9-10]，以乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度 （C） 和提取時間 （D）為自變量，以總氨基酸提取率為響應值（Y） 進行實驗設計，各因素水平設計見表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗設計和結果見表3。

采用Design-Expert8.0.6軟件分析試驗結果，以總氨基酸的提取率為響應值，對實驗數據進行二次多項式回歸擬合，得回歸方程為：Y=0.62-0.011A+0.010B-0.013C+0.033D-4.500E-003AB-6.000E-003AC-0.016AD+0.013BC+0.012BD-5.000E-004CD-0.041A2-0.031B2-0.040C2-0.055D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件對方程及各因子進行方差分析，分析結果見表4。由表4可知，以白刺花的總氨基酸的提取率為響應值，回歸方程顯著性檢測 P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項的P值為0.2445，不顯著，R2=0.9713，表明回歸方程模型與實際實驗擬合性比較好，試驗誤差較小，說明采用響應面法優化白刺花中總氨基酸提取工藝是可行的，具有參考性[11]，其中各影響因素對白刺花總氨基酸提取率的影響順序為：提取時間>提取溫度>乙醇濃度>加液量。