羅氏沼蝦病原陰溝腸桿菌藥物敏感性測定與分析

李席席，皮大明，高曉建，陳 楠，劉曉丹，張瑩瑩，付立霞，葉金明，張曉君

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇揚(yáng)州 225101)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是原產(chǎn)于印度洋太平洋地區(qū)的一種淡水蝦類，其生長速度較快，當(dāng)年繁殖蝦苗經(jīng) 3—5個月養(yǎng)殖即可達(dá)上市規(guī)格，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，目前已經(jīng)成為內(nèi)陸重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，我國也已成為全球羅氏沼蝦最大養(yǎng)殖國[1]。在羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，苗種質(zhì)量、水質(zhì)環(huán)境、病害等已成為主要的制約因素。近年，我國南方多家羅氏沼蝦苗種場在幼體培育階段發(fā)生暴發(fā)性死亡，幼體表現(xiàn)為食欲下降空胃，體色發(fā)黑發(fā)紅，活力下降不能正常蛻皮變態(tài)。該病在幼體培育初期即開始發(fā)病，持續(xù)整個培育期，使得育苗產(chǎn)量嚴(yán)重下降，經(jīng)濟(jì)損失巨大[2]。2017年春季，江蘇省高郵市部分羅氏沼蝦育苗場發(fā)生羅氏沼蝦幼體大規(guī)模死亡現(xiàn)象，將發(fā)病的幼體用氧氣袋運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)表型和分子生物學(xué)鑒定引起多家育苗場幼體大批死亡的病原之一為腸桿菌屬(Enterobacter)的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。

陰溝腸桿菌是人腸道致病菌，在機(jī)體抵抗力下降時，可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、傷口及敗血癥感染，已構(gòu)成醫(yī)院內(nèi)感染的一種重要病原菌[3]；有資料表明該菌對雞、豬等動物具有致病作用，主要是引起以腹瀉為主要癥狀的感染[4]。近年來有關(guān)該菌對水產(chǎn)動物的致病性也有報(bào)道，Seker 等[5]報(bào)道了陰溝腸桿菌對健康鯔 (Mugilcephalus)具有較強(qiáng)的致病性，鯔感染該菌會造成大量死亡，陳雪峰等[2]報(bào)道了陰溝腸桿菌是導(dǎo)致2010 年浙江湖州某幾個羅氏沼蝦育苗場幼體大規(guī)模發(fā)病死亡的致病菌。本研究采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測試了分離的羅氏沼蝦病原陰溝腸桿菌對35種抗菌類藥物的敏感性，同時采用試管稀釋法測定了6種抗菌藥物對對陰溝腸桿菌的MIC和MBC，為羅氏沼蝦育苗生產(chǎn)中陰溝腸桿菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

2017年春季江蘇省高郵市部分羅氏沼蝦育苗場幼體及仔蝦出現(xiàn)大批死亡，發(fā)病幼體及仔蝦表現(xiàn)為活力減弱，身體微紅。將發(fā)病羅氏沼蝦幼體用氧氣袋打包運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，從不同育苗場羅氏沼蝦中分離出5株陰溝腸桿菌,編號為：XL1、XL2、LW1、WJ1、GXFL1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司；6種抗菌藥物購自北京索萊寶科技有限公司，品名批號見表1。

表1 供試用藥物Tab.1 The test drugs

目前紅霉素、頭孢曲松以及諾氟沙星在生產(chǎn)上已經(jīng)被列為漁用禁藥，僅為實(shí)驗(yàn)研究提供參考。鹽酸土霉素、氟苯尼考以及恩諾沙星是生產(chǎn)上常用的三種抗菌藥物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離

取發(fā)病幼體及仔蝦，用生理鹽水清洗后做勻漿處理，無菌操作取勻漿液劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，選取優(yōu)勢生長的單菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純培養(yǎng)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７蛛x菌株經(jīng)表型特征、理化特性及分子生物學(xué)鑒定為陰溝腸桿菌。

1.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散(K-B)法對35種抗菌類藥物的敏感性進(jìn)行測定，將供試的5株陰溝腸桿菌純培養(yǎng)物分別接種于普通營養(yǎng)肉湯，在28 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上加入100 μL菌液并涂布均勻，待自然晾干后，再用滅菌眼科鑷取藥敏紙片分別平貼于涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，每個平板貼6張紙片，重復(fù)三次，置28 ℃培養(yǎng)24 h測量抑菌圈直徑，對照產(chǎn)品說明書判定敏感性。

1.2.3 制備菌懸液

將菌株WJ1接種于普通營養(yǎng)肉湯中，置28 ℃培養(yǎng)24 h，采用平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為108CFU/mL，然后采用倍比稀釋法將菌液稀釋到106CFU/mL。

1.2.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定

首先用滅菌生理鹽水將供試藥物原液稀釋到2×10-1mg/mL，共設(shè)14個濃度(mg/L=g/m3)，采用逐級稀釋法[6]，使各管藥液終濃度為30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 mg/L。然后加入0.1 mL濃度為106CFU/mL的活菌液WJ1，每個濃度設(shè)3管重復(fù)，第15管為不加藥液的陽性對照。輕搖混勻使被測菌與藥液充分接觸，置28 ℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察呈現(xiàn)澄清且搖動后仍澄清者，則表示無細(xì)菌生長(被抑制)，若呈混濁狀態(tài)則表示有細(xì)菌生長(無抑制)。無細(xì)菌生長的最大稀釋度的藥液，即為該藥物的最小抑菌濃度。從澄清的試管中吸取0.1 mL，涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)48 h后，仍無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為供試藥物對細(xì)菌的最小殺菌濃度[7]。

2 結(jié)果

2.1 5株陰溝腸桿菌對35種抗菌類藥物的敏感性

紙片擴(kuò)散法測定5株陰溝腸桿菌對供試35種抗菌類藥物敏感性結(jié)果見表2。結(jié)果表明：5株陰溝腸桿菌對青霉素類藥物、磺胺類藥物、呋喃類藥物的敏感性最差，對頭孢菌素類中的頭孢吡肟、氨基糖苷類中的阿米卡星、四環(huán)素類中的米諾環(huán)素、單環(huán)內(nèi)酰胺中的氨曲南的敏感性最好，對喹諾酮類藥物中的諾氟沙星、氨基糖苷類藥物中的慶大霉素和妥布霉素以及鏈霉素和卡那霉素、酰胺醇類藥物中的多粘菌素B敏感性次之，此外，5株陰溝腸桿菌對青霉素類、頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、酰胺醇類這七大類藥物的耐藥性都存在株間差異現(xiàn)象。

表2 陰溝腸桿菌對35種抗菌藥物的敏感性Tab.2 The antimicrobial sensitivity of pathogenic E.cloacae to 35 drugs

注：S為敏感；I為中度敏感；R為耐藥；D為株間差異。

2.2 6種藥物對菌株WJ1的最小抑菌濃度

6種藥物對陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度見表3。結(jié)果表明鹽酸土霉素的最低抑菌濃度為4 mg/L，氟苯尼考的最低抑菌濃度為5 mg/L，諾氟沙星的最低抑菌濃度為3 mg/L，頭孢曲松的最低抑菌濃度為25 mg/L，在供試6種藥物中，恩諾沙星對陰溝腸桿菌的抑菌效果最好，在1～30 mg/L的藥物濃度范圍內(nèi)均無菌體生長，其次是諾氟沙星；鹽酸土霉素和氟苯尼考的抑菌效果僅次于諾氟沙星，頭孢曲松的抑菌效果比鹽酸土霉素、氟苯尼考和諾氟沙星要差一些；其中紅霉素的抑菌效果最差，在所設(shè)置的藥物濃度范圍內(nèi)均有菌體生長。

供試驗(yàn)所用的6種藥物對陰溝腸桿菌的抑菌效果由強(qiáng)到弱依次為：恩諾沙星、諾氟沙星、鹽酸土霉素、氟苯尼考、頭孢曲松、紅霉素。

表3 6種抗菌藥對陰溝腸桿菌的最小抑菌濃度(MBC)Tab.3 The minimum bactericidal concentration of six kinds of antimicrobial drugs to E.cloacae

注：表中“-”表示無細(xì)菌生長，“+”表示有細(xì)菌生長。表4同。

2.3 6種藥物對菌株WJ1的最小殺菌濃度

6種常用藥物對陰溝腸桿菌的最小殺菌濃度見表4。結(jié)果表明鹽酸土霉素的最小殺菌濃度為8 mg/L；氟苯尼考的最小殺菌濃度為10 mg/L；恩諾沙星的最小殺菌濃度為4 mg/L；諾氟沙星的最小殺菌濃度為7 mg/L；綜合上述研究結(jié)果，在供試的6種藥物1～30 mg/L濃度范圍內(nèi)，恩諾沙星對陰溝腸桿菌的殺菌效果最好，使用較低的藥物濃度即可殺死病原陰溝腸桿菌；其次是諾氟沙星；鹽酸土霉素的殺菌效果也相對明顯，僅次于諾氟沙星；而氟苯尼考的殺菌效果略差于鹽酸土霉素，紅霉素和頭孢曲松2種藥的殺菌效果最差。

表4 6種抗菌藥對陰溝腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Tab.4 The minimum bactericidal concentration of six kinds of antimicrobial drugs to E.cloacae

注：表中“-”表示無細(xì)菌生長，“+”表示有細(xì)菌生長。

3 討論

抗菌類藥物是治療水產(chǎn)動物細(xì)菌性感染的有效技術(shù)性手段之一，目前，抗菌藥物在水產(chǎn)動物疾病防治中多有報(bào)道。姜光明等[8]研究了9種抗菌類藥對中華絨螯蟹和克氏原螯蝦的病原菌維氏氣單胞菌以及弗氏檸檬酸菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)其對氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星的等4種抗生素敏感。韋信賢等[9]從臨死的山瑞鱉組織中分離出1株致病性細(xì)菌，抑菌結(jié)果表明該菌對16種抗菌藥物中的阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星藥物敏感，對頭孢哌酮、慶大霉素、諾氟沙星中度敏感，對氨芐青霉素等10種抗生素均存在不同程度的耐藥。薛慧娟等[10]研究了喹諾酮類藥物對從臨床上分離的59株嗜水氣單胞菌的耐藥性，結(jié)果顯示分離的嗜水氣單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥程度不一，其中萘啶酸的耐藥最為嚴(yán)重，諾氟沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感性較高。本實(shí)驗(yàn)研究了35種抗菌類藥物對從瀕臨死亡的羅氏沼蝦體內(nèi)分離的5株陰溝腸桿菌的抑菌效果，結(jié)果表明菌株對青霉素類藥物、磺胺類藥物、呋喃類藥物的敏感性最差，而對頭孢菌素類中的頭孢吡肟、氨基糖苷類中的阿米卡星、四環(huán)素類中的米諾環(huán)素、單環(huán)內(nèi)酰胺中的氨曲南的敏感性最好。

恩諾沙星屬第三代氟喹諾酮新藥，具有良好的抗菌活性，而且殺菌力強(qiáng)、吸收快，被廣泛用于魚蝦類養(yǎng)殖行業(yè)[11]，國外的研究結(jié)果也表明，恩諾沙星不僅在魚體內(nèi)殘留消除的速度相對較快而且對水產(chǎn)動物的病原菌有良好的抑殺能力[12-13]。此外，本研究中，恩諾沙星對陰溝腸桿菌的殺菌效果最好，因此可首選恩諾沙星防治漁業(yè)生產(chǎn)上陰溝腸桿菌的爆發(fā)。鹽酸土霉素是一種較為傳統(tǒng)的人畜共用的抗生素，本實(shí)驗(yàn)中對陰溝腸桿菌的抗菌效果僅次于諾氟沙星。諾氟沙星是氟喹諾酮類抗菌藥物的一種，具廣譜抗菌作用，且抑菌能力強(qiáng)[14]，由于恩諾沙星對水產(chǎn)動物和水環(huán)境危害嚴(yán)重，現(xiàn)已被列為水產(chǎn)上的禁用藥物。氟苯尼考是動物專用的氯霉素類新型廣譜抗生素，在本次實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對陰溝腸桿菌效果不及恩諾沙星、諾氟沙星以及土霉素。在生產(chǎn)上也可以用于防治陰溝腸桿菌引發(fā)的羅氏沼蝦幼體發(fā)病。由于氟苯尼考具有抗菌活性以及在水產(chǎn)病害防治過程中的安全性，將有助于羅氏沼蝦養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[15]。

抗菌藥物的使用的確為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)避免了大量經(jīng)濟(jì)損失，但是隨著抗菌藥物長期并且大量使用，使得致病菌的耐藥性逐漸凸顯出來[16]。因此在預(yù)防與治療水產(chǎn)動物細(xì)菌性病害的養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中，要避免盲目大量的用藥使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致耐藥性增強(qiáng)[17-18]。