4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的急性毒性研究

羅鳴鐘，楊曼綺，郭 坤，阮國良，楊代勤

(長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025)

黃鱔(Monopterusalbus)俗稱鱔魚，是我國重要的名優水產養殖種類之一。其含肉率高達70%，肌肉中蛋白質含量達18.8%,而脂肪含量低于1%[1]，具有高蛋白低脂肪的特點，味道鮮美，營養豐富，深受我國和東南亞人民的喜愛。目前，我國以及日本、朝鮮、越南等東南亞國家均開展了黃鱔的集約化養殖[2]。而湖北省作為我國黃鱔養殖的第一省，鱔魚產量占全國的50%以上。2015年湖北省黃鱔養殖產量已達到17.21萬噸，產值超百億元，湖北省水產局已將黃鱔養殖業作為3個“百億元”的名優水產品產業之一，在“十三五”進行優先發展和重點扶持打造[3]。目前，黃鱔養殖主要以基于池塘的網箱養殖為主。隨著農業生產的發展，有機磷農藥的大量使用造成水域生態環境污染，野生鱔苗種自然資源量急劇減少，苗種短缺已成為制約黃鱔養殖業發展的主要瓶頸[4]。

有機磷農藥是有機磷酸脂類農藥的簡稱，具有高效、快速、廣譜性的特點，常被作為高效殺蟲劑和植物生長調節劑而廣泛用于農業生產中，是世界上生產和使用最多的農藥品種之一。有機磷能抑制膽堿脂酶活性，引起乙酰膽堿代謝紊亂，其代謝產物能抑制神經傳導，引起一系列神經綜合癥，對水生動物具有很強的急性毒性[5]。研究表明，在農藥施用過程中，僅有1%左右作用于靶生物，其余的或殘留于土壤，或通過間接途徑進入水環境[6]。水體是有機磷的主要歸宿，農業、漁業活動使用的有機磷農藥最終會匯入水環境中，對微生物、水生動物產生較大的危害。有機磷農藥對同種魚類的不同組織和不同魚類的同種組織中乙酰膽堿脂酶的抑制程度不同[7]，因此，有機磷農藥對魚類的毒性存在種間差異。目前，關于常見的有機磷農藥如：氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲等對黃鱔的急性毒性尚未見報道。

長江大學黃鱔研究團隊從事黃鱔基礎及應用研究近20年，于2013年取得突破，摸索出稻田網箱仿生態黃鱔繁殖技術，獲得黃鱔苗種超過百萬尾[8]。了解稻田常用農藥對黃鱔幼魚的毒性效應，對于完善和推廣稻田網箱仿生態黃鱔繁殖技術具有重要的實踐意義。本研究以黃鱔幼魚為研究對象，采用半靜態方式水生生物急性毒性實驗法，研究農業生產上常用的有機磷農藥：氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲對其的急性毒性效應，得出半數致死濃度、安全濃度以及藥物毒性蓄積程度系數，為黃鱔野生資源的保護以及苗種的人工繁育技術提供理論依據，并為池塘養殖環境的生態風險評估與管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為長江大學黃鱔研究所繁育的黃鱔幼魚，體質量(0.03±0.01)g，體長(3.71±0.27)cm，挑選外觀正常，體質健康，規格接近的個體用于實驗。實驗前暫養于實驗室，用水為曝氣的自來水，氣泵連續充氣，溫度為(27.0±1.5)℃，pH為7.5 ～8.0，溶氧 ≥ 6.0 mg/L。

氧樂果由河北軍星生物化工有限公司生產，有效成分 40%；乙酰甲胺磷由湖北沙隆達股份有限公司生產，有效成分30%；馬拉硫磷由遼寧葫蘆島凌云農藥化工有限公司生產，有效成分45%；敵百蟲由江蘇綠野農化有限公司生產，有效成分90%。按4種農藥的有效濃度配置試驗液。

1.2 實驗方法

選擇5個間距較大的試液濃度進行預實驗，觀察幼魚在24 h內的情況，得出幼魚的最大無死亡質量濃度和全部致死濃度。依照預實驗的結果來設置正式實驗的藥品濃度梯度。

實驗采用半靜態方式水生生物急性毒性實驗法[9]。實驗期間不投餌，為保證實驗藥液質量濃度，每隔 24 h 更換藥液1 次。根據預實驗結果按等對數間距設計6個質量濃度梯度，見表1。每濃度組10尾幼魚，設3個平行組，1個空白對照組。實驗開始后6 h連續觀察幼魚的反應情況并記錄，以后在24、48、72、96 h觀察，記錄死亡數據并及時清出死亡個體。死亡判斷標準為：目測無可視動作發生 (如鰓蓋運動)、 碰觸尾柄后無反應，即可判斷該魚死亡。

表1 4種有機磷農藥的實驗濃度Tab.1 The concentrations of four organophosphorus pesticides /(mg/L)

1.3 數據處理

采用寇式法(Karber)計算半致死濃度(LC50)、安全濃度(SC)和半致死濃度的95%置信區間(CI)，并做實驗濃度對數為橫坐標與死亡率為縱坐標的直線回歸方程[9]，利用藥物毒性蓄積程度系數(MAC)來分析黃鱔體內對有機磷農藥的蓄積、降減變化[10]，相關計算公式如下：

半致死濃度(LC50，mg/L)：Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

安全濃度(SC，mg/L)：SC=48 h LC50× 0.3 / (24 h LC50/48 h LC50)2

半致死濃度95%置信區間(CI，mg/L)：95% CI=Log LC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

藥物毒性蓄積程度系數(MAC，%)：MAC=100% ×(t1LC50-t2LC50)/(t0LC50-tmLC50)

上式中：Xm為有機磷農藥最大濃度的對數，d為相鄰濃度的對數差值，p為死亡率(%)，為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組實驗魚尾數；t1LC50和t2LC50為觀察時段t1和t2的半致死濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為實驗初始、結束時半致死濃度(mg/L)。

2 結果

2.1 中毒癥狀

實驗初期，4種農藥低濃度組(濃度Ⅰ和Ⅱ)的黃鱔幼魚均集中于燒杯底部，靜止不動或偶爾游動。4 h后，4種藥液的中高濃度組(濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的幼鱔活動逐漸變得頻繁而急躁，表現為部分在水底急游后便向水面竄，接著緩慢下沉。6 h后，乙酰甲胺磷和敵百蟲藥液的中高濃度組便有幼鱔直立在水中，頭部探向水面。隨著時間的延長，4種藥液高濃度組的幼魚先后開始在底部低頻率的輕微抽搐，時而游竄到水面后便很快無力下沉。8 h后，4種藥液的高濃度組中部分幼鱔開始持續性地劇烈抽搐，身體扭曲且緊繃痙攣，體色由黑色變為淺灰且略透明，暗紅色的血管和心臟清晰可見，表現為血管收縮、膨大的心臟在激烈的搏動。同時幼鱔在應激過程中粘液分泌量增多，馬拉硫磷藥液中的幼魚應激持續時間較其他三種更長。

2.2 4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的急性致死效應

表2顯示，在96 h的毒性實驗中對照組均未發生死亡，各濃度處理組幼鱔的死亡率均隨藥物濃度增加、實驗時間延長而上升。低濃度的氧樂果和敵百蟲對幼鱔急性致死效應較小，96 h的死亡率均低于10%。四種有機磷農藥最高實驗濃度對幼鱔急性致死效應較大，除24 h時的馬拉硫磷，其余時間各組均表現出100 %的死亡率。各農藥的空白對照組均無死亡現象。

表2 4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的致死率Tab.2 Death rates of four organophosphorus pesticides to juvenile M.albus

續表2

2.3 4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的毒性效應

根據相關計算公式[10-11]得出氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲對黃鱔幼魚的半致死濃度LC50、半致死濃度的95%置信區間CI、藥物毒性蓄積程度系數MAC和安全濃度SC(表3)。半致死濃度均隨實驗時間的延長而下降，氧樂果對幼鱔24、48、72、96 h的半致死濃度分別為6.190、4.460、3.042、1.761 mg/L，乙酰甲胺磷為67.350、60.954、55.804、51.286 mg/L，馬拉硫磷為5.058、3.981、3.404、2.992 mg/L，敵百蟲為13.622、6.993、3.303、2.308 mg/L。安全濃度由低到高為：敵百蟲0.553 mg/L，氧樂果0.695 mg/L，馬拉硫磷0.740 mg/L，乙酰甲胺磷14.978 mg/L。四種有機磷農藥對黃鱔幼魚的藥物毒性蓄積程度系數均隨實驗時間的延長而下降，氧樂果和馬拉硫磷的MAC下降較慢，而乙酰甲胺磷和敵百蟲下降較快。

根據藥物濃度對數和死亡率—概率單位的關系計算出 4 種藥物 24 h、48 h 和 96 h 的回歸方程如表 4 所示。

表3 4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four organophosphorus pesticides on juvenile M.albus

續表3

表4 4種有機磷農藥對黃鱔幼魚的回歸方程Tab.4 Regression equations of four organophosphorus pesticides for juvenile M.albus

注：*表示差異顯著(F0.05F0.01)。

3 討論

3.1 4種農藥對黃鱔幼魚的急性毒性比較

農藥對魚類的急性毒性的強弱一般用半致死濃度(LC50)來衡量，且呈負相關，即LC50值越小，農藥的毒性越強；LC50值越大，毒性越弱[12]。本研究得出了4種有機磷農藥對黃鱔幼魚 24、48、72、96 h 的LC50值，但一般較多采用 96 h LC50來確定藥物對水生動物的急性毒性大小。根據國家環保總局發布的毒性分類標準[13]，急性毒性96 h LC50<0.1 mg /L為劇毒，0.1～1.0 mg /L為高毒，1.0～10.0 mg /L為中毒，>10.0 mg /L為低毒。本實驗結果表明乙酰甲胺磷對黃鱔幼魚的96 h LC50為51.286 mg/L，屬低毒，氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲的96 h LC50分別為1.761 mg/L、2.992 mg/L和2.308 mg/L，均屬中毒。4種農藥對黃鱔幼魚的毒性大小為：氧樂果>敵百蟲>馬拉硫磷>乙酰甲胺磷。本結果也表明，相對于氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等有機磷農藥，乙酰甲胺磷對黃鱔的毒性較小，在黃鱔養殖周邊的稻田應盡量選擇乙酰甲胺磷，而必須嚴格控制氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等有機磷農藥的使用量以及廢藥處理。

本實驗中所用4種藥物均屬于有機磷農藥，但對黃鱔幼魚的毒性存在差異。有機磷農藥對水生動物致毒作用機理主要是抑制乙酰膽堿脂酶活性，造成乙酰膽堿的大量蓄積而不能水解，致使后續神經元或效應器持續興奮，引起痙攣麻痹等中樞神經系統癥狀。當組織中膽堿脂酶抑制達40%～60%時，動物可在幾秒鐘內死亡[14]。一般認為毒性差異的主要原因是有機磷農藥分子結構差異所造成，對膽堿酯酶分子親和力越強，毒性越大[15-16]。本實驗也表明農藥的物理特性如水溶性也與其毒性有一定關系，水溶性可促進毒性増強，如氧樂果水溶性高達39 800 mg/L[17]。

3.2 4種農藥在黃鱔幼魚體內的蓄積與降減的特征分析

MAC即藥物毒性蓄積程度系數，常作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數，來分析生物體對藥物的蓄積與降減動態[18]。MAC值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；MAC>0 時，蓄積作用強度大于降減作用，反之亦然。

據表3可知，4種有機磷農藥的MAC值均在24～48 h間出現最大值且均大于0，表明此時間段內毒性在幼鱔體內蓄積的作用頗強，蓄積作用強度遠大于降減作用，即為其死亡高峰時段；而后MAC值隨著時間的延長而下降，表明幼鱔對有機磷農藥毒性的抵抗能力逐漸上升，毒效漸漸消減。通過比較4種有機磷農藥的MAC值，發現幼鱔對氧樂果和乙酰甲胺磷在各實驗時間段蓄積幅度較為均衡，說明其毒效蓄積較強，降解毒效能力較差；在實驗48～96 h幼鱔對馬拉硫磷和敵百蟲的MAC值下降明顯，馬拉硫磷實驗72～96 h的MAC值是24～48 h的38.22%，敵百蟲實驗72～96 h的MAC值是24～48 h的15.01%，說明其降解毒效能力較強，毒效蓄積速度下降，敵百蟲實驗尤為明顯。故在探討農藥對生物的毒性效應時，應分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效對其的影響。

3.3 4種農藥對黃鱔幼魚的安全性評價

黃鱔人工苗種數量緊缺已成為我國黃鱔養殖產業發展的瓶頸，如何提高黃鱔苗種繁育的規模和選育出黃鱔良種，是當前黃鱔研究的熱點和難點。長江大學黃鱔研究團隊雖然研發出了黃鱔稻田網箱仿生態繁育技術，可人工繁育生產黃鱔苗種，但此項技術仍不成熟，且受環境條件影響大，難以實現高效的規模繁育生產。稻田作為黃鱔生態繁育的主要場所，其土壤和水體環境對其繁殖效果產生重要影響。本研究采用急性毒性實驗方法，結果表明氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲對黃鱔幼魚屬中毒，乙酰甲胺磷為低毒。但部分有機磷農藥可通過對環境的吸附、移動以及生物富集等作用，長期存在于大氣、土壤(沉積物)和水體環境中[19-20]。有機磷農藥進入環境后對靶標和非靶標生物群落均會產生影響，其對黃鱔的慢性毒性如何，尚需進一步研究。同時，應考慮水溫、pH、溶解氧、有機物、各種水生生物等諸多因子的影響，如敵百蟲在堿性環境下會轉化為毒性更強的敵敵畏[21]。

基于本研究結果，建議在進行黃鱔稻田繁育和養殖前，應檢測土壤和水體中的有機磷農藥的殘留情況。同時應嚴格控制周邊稻田中氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等中高毒農藥的使用以及廢藥的處理，在使用過程中需密切觀察黃鱔的活動情況。