草魚肌肉中呋喃唑酮代謝物AOZ檢測能力 驗證樣品的制備研究

田娟娟，甘金華，彭 婕，李晉成，劉 歡

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院，北京 100141； 3.農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141； 4.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)屬于硝基呋喃類抗菌劑的范疇，在水產養殖中曾被廣泛應用于治療魚類疾病或細菌引起的其它疾病[1]。FZD的代謝產物 3-氨基-2-惡唑烷酮 (3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)半衰期較長，具有致畸胎和致突變的副作用，且能誘發癌癥[2-4]。美國、歐盟等其他國家和地區均禁止FZD作為獸藥使用[2,5,6]。我國農業部公告規定禁止在食用動物上使用FZD等硝基呋喃類藥物(193號令[7])，但實際養殖、運輸、暫存等生產和流通過程中，仍有大量違規使用FZD的行為。AOZ等硝基呋喃類藥物代謝物仍然是水產品質量安全的重點監管對象，從近年來國家認監委、農業部等部門組織開展的水產品藥物殘留檢測能力驗證看，AOZ等硝基呋喃類代謝物是每年必考的指標之一。

能力驗證是評估實驗室檢測能力的重要手段和途徑，而能力驗證樣品的成功研制保證了該項目的順利進行。能力驗證樣品制備一般有兩種方法，自然機體污染法和空白基質加標法。前者是是將藥物直接飼喂或藥浴動物，得到含有藥物的陽性樣品，后者是將藥物標準溶液添加至空白樣品中[8]。兩種方法得到的樣品在檢測難易程度上存在很大差別，前者目標檢測物是與動物體內的蛋白相結合，存在“內化”的情況，后者是目標檢測物僅附著在考核樣品表層。自然機體污染法制備的能力驗證樣品更接近于真實樣品，更能反映出檢測人員的監測水平。采用自然機體污染法制備樣品時，樣品中目標物殘留濃度要在適當水平，如果目標物殘留濃度過高，分析時易污染儀器設備，可能達不到區分各實驗室檢測能力的目的；如果目標物殘留濃度過低，分析變異系數大，增加實驗室操作難度，不易出現具有統計學意義的結果[9]。有研究表明，在以活體動物為基礎的能力驗證樣品制備上，影響因素很多，包括給藥方式、給藥濃度、水溫、養殖時間等養殖條件、養殖品種、規格等因素[10-12]，但是關于如何控制上述因素以實現能力驗證考核樣品需要的藥物殘留濃度還鮮有報道。因此，本文研究了水溫、藥浴時間等因素對草魚肌肉中呋喃唑酮代謝物殘留濃度的影響，并以肌肉基質中殘留濃度為8 μg/kg和25 μg/kg為目標，確定草魚基質中呋喃唑酮代謝物殘留檢測能力驗證樣品的養殖試驗條件，為后續水產品中呋喃唑酮代謝物AOZ殘留檢測能力驗證樣品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚(購于湖北省武漢市洪山區茅店社區萬達菜市場，不同批次)，隨機取樣，經HPLC-MS檢測，未檢出呋喃唑酮代謝物；活躍狀態良好，規格大小均一(900～1 100g/尾)。給藥前暫養于消毒后的水箱中，水溫(25±1)℃，不間斷增氧，不投餌，每天換1次水，暫養1～2 d，剔除不健康、受傷的草魚(有明顯傷痕)后用于實驗。

呋喃唑酮原料藥(梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，純度>98%，實際純度97.74%)；AOZ標準物質(德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；AOZ-D4同位素內標(德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；乙腈(色譜純，美國J.T.Baker公司)；甲醇(色譜純，美國J.T.Baker公司)；乙酸乙酯(色譜純，美國J.T.Baker公司)；醋酸銨(分析純，美國J.T.Baker公司)；二甲亞楓(Tedia 公司)；2-硝基苯甲醛(EU)；K2HPO4(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，純度≥99%)；鹽酸(優級純，信仰市化學試劑廠)。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜儀(Thermo公司)；分析天平(Mettler Toledo)；旋渦混合器(北方同正，型號HQ-60-Ⅱ)；高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠，GL-20B)；氮吹儀(上海川翔生物科技有限公司，KD200)；飛利浦攪拌器；藥浴池為方形玻璃水族箱，規格尺寸分別為長135.7 cm×寬57 cm×高54 cm；長69 cm×寬57 cm×高54 cm；

1.3 實驗方法

1.3.1 養殖條件的確定

1.3.1.1 藥浴時間的確定

藥浴初始濃度為97.98 μg/L，藥浴池中水溫保持在(25±1)℃，一次放入草魚35尾，以空氣泵持續增氧，連續藥浴24 h后100 %換水。樣品采集點分別為藥后2、4、8、10、12、16、18、24、28、32、48 h，每個時間點隨機取草魚3尾，3尾作為一個樣品。每個時間捕撈的草魚立即處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測分析AOZ殘留量，同一樣品平行測定3次，取其平均值作為各時間點肌肉中AOZ的殘留濃度。

1.3.1.2 藥浴溫度的確定

兩組試驗水溫分別保持在(25±1)℃和(20±1)℃，高溫組和低溫組各放草魚35尾，以空氣泵持續增氧，連續藥浴24 h后100 %換水。呋喃唑酮藥浴初始濃度、采樣點等操作均與樣品中AOZ含量的檢測“1.3.1.1 ”保持一致。

1.3.2 草魚肌肉中AOZ含量(y)與藥浴初始濃度(x)相關性研究及驗證

1.3.2.1y與x關系的建立

呋喃唑酮初始藥浴濃度為97.87 μg/L，藥浴池中水溫保持在25 ℃左右，以空氣泵持續增氧，一次放入5尾。達到最佳藥浴時間后，立即捕撈處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測分析AOZ殘留量，同一樣品平行測定3次，取其平均值作為該時間點肌肉中AOZ的殘留濃度。根據得出的藥浴最佳時間時對應草魚體內AOZ含量y值，已知初始藥浴濃度x=97.87 μg/L，建立y=kx的線性關系。

1.3.2.2y與x關系的驗證

根據上述建立的關系式y=kx，即可算出預期得到藥后草魚肌肉中AOZ含量8 μg/kg和25 μg/kg分別對應的呋喃唑酮初始藥浴濃度分別為36.29 μg/L和113.54 μg/L，藥浴池中水溫保持在25 ℃左右，藥浴時間10 h，以空氣泵持續增氧，每個藥浴池每次放入8～9條規格統一的草魚。隨機采集兩個水族箱中藥浴時間為最佳時間10 h的草魚各6尾，立即處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測分析AOZ殘留量，同一樣品平行測定3次，取其平均值作為該時間點肌肉中AOZ的殘留濃度。高濃度組和低濃度組殘留分別經過6個批次的平行實驗，驗證上述建立的關系式y=kx的正確性。

1.3.3 能力驗證樣品的制備

根據上述條件建立的養殖實驗條件，制備草魚肌肉中AOZ含量約為10.0 μg/kg的能力驗證樣品，藥浴濃度為45 μg/L，藥浴時間10 h，藥浴溫度25 ℃。從市場直接購買的活草魚，暫養1～2 d后，剔除受傷不健康的草魚，隨機取樣檢測確定為陰性樣品后，按照上述條件建立的養殖實驗條件進行藥浴、捕殺，取其背部肌肉部分，充分混合均勻，制成魚糜。然后對制得的魚糜進行分裝，每份樣品約10.0 g，共140份，-20 ℃冷凍保存，以備進一步做均勻性和穩定性檢驗。

1.3.4 均勻性和穩定性檢驗

樣品均勻性和穩定性按照“能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南(CNAS-GL03)”要求進行。

1.3.4.1 均勻性檢驗

從制備的能力驗證樣品中各隨機抽取10份樣品進行均勻性檢測，每份樣品重復測定2次，分析樣品中AOZ的含量。檢測結果用單因素方差分析(Anova)來判斷樣品的均勻性。

1.3.4.2 穩定性檢驗

本實驗對能力驗證樣品進行了短期穩定性和長期穩定性檢測。評估穩定性研究的數據的第一步是檢查數據中是否有任何觀察到的趨勢。對于微小的不穩定性問題，由于內在動力學機理未知，因此線性擬合是一個合適的模型，穩定性研究的基本模型可表示為[13]：

y=β0+β1x+ε

式中：β0和β1—回歸系數；ε—隨機誤差分量；x—時間；y—樣品中AOZ含量。

斜率的估計值b1可按下式計算：

截距的估計值b0可按下式計算：

直線的標準偏差S：

斜率的標準偏差S(b1)：

在置信水平為95%時，如果│b1│

1.3.4.2.1 短期穩定性

短期穩定性進行30 d，按照先密后疏的原則，選取0、3、7、15、30 d 5個時間點進行測定。每次測定隨機抽取3份樣品，平行測定2次，進行樣品的短期穩定性分析。

1.3.4.2.2 長期穩定性

樣品長期存放在-20 ℃冰箱中保存，長期穩定性為期6個月，每個月測定1次。穩定性每次測定隨機抽取3份樣品，平行測定2次，進行樣品的短期穩定性分析。

1.4 AOZ殘留量檢測方法

樣品中AOZ殘留量分析方法按照農業部783號公告-1-2006《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》進行[14]。

1.5 數據分析統計

分析草魚肌肉中AOZ殘留量與藥浴初始濃度的相關性。采用軟件SPSS 20.0對實驗數據進行單因素方差分析(Anova，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 標準樣品曲線及回收率

標準曲線范圍為0.5～100 ng/mL，高濃度樣品選取0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL 7個濃度梯度；低濃度樣品選取0.5、1、2、5、10、20 ng/mL 6個濃度梯度制備標準曲線，得到的線性方程分別為y=0.222 6x+0.035 6，y=0.223 8x- 0.047 8，相關系數r2均大于0.999。每次檢測均設草魚空白及質控樣品，AOZ在空白草魚基質中的回收率均為80%～110%，在方法規定的70%～110%范圍，說明了檢測結果的可靠性。

2.2 養殖條件的確定

2.1.1 藥浴時間的確定

草魚肌肉中AOZ殘留量每個采樣點平均值隨藥浴時間變化趨勢如圖1所示。

圖1 不同藥浴時間下草魚肌肉中呋喃唑酮代謝物 AOZ含量的變化Fig.1 Changes of the content of furazolidone metabolites AOZ in the muscle of grass carp under different bath time

圖1 中可知，在給藥后0～8 h是藥物吸收的過程，草魚肌肉中AOZ殘留隨著時間的延長而迅速升高，8～18 h藥物吸收和消除達到一個動態平衡的過程，殘留濃度變化趨勢相對平緩，之后18～24 h藥物殘留濃度又進一步升高，24 h時殘留量達到峰值，24 h后全部換水后，藥物殘留進入消除階段，隨著時間的推移AOZ殘留濃度逐漸降低。

2.1.2 藥浴溫度對草魚肌肉中AOZ殘留的影響

通過在20 ℃和25 ℃兩種不同水溫條件下進行藥浴實驗，檢測不同藥浴時間下呋喃唑酮在草魚肌肉中的殘留量見圖2。由圖2可知，20 ℃條件下草魚肌肉中AOZ的含量明顯低于25 ℃條件下肌肉中AOZ含量，2～8 h 25 ℃條件下草魚對藥物的吸收速率明顯高于20 ℃條件下的吸收速率，在25 ℃的條件下，8 h后藥物吸收和消除達到動態平衡，24 h達到峰值，峰值濃度為(24.98±1.54)μg/kg。在20 ℃條件下，需10 h后藥物吸收和消除才達到動態平衡，24 h并未出現峰值(24 h后100%換水)，說明在高溫魚體代謝藥物富集作用更快，低溫條件下較慢，低溫條件下達到峰值需要更長的時間。

圖2 不同溫度下草魚肌肉中呋喃唑酮代謝物AOZ殘留量Fig.2 Residual amount of furazolidone metabolite AOZ in muscle of grass carp at different temperatures

2.3 y與x的相關性及驗證

根據實驗藥浴初始濃度x=97.87 μg/L，10 h后捕殺，經檢測草魚肌肉中AOZ含量y=21.57 μg/kg，確定y與x的關系為y=0.22x。對線性方程y=0.22x進行6～7個批次的平行驗證，檢測結果見表1和表2。

表1 低濃度各批次草魚肌肉中AOZ殘留測定數據(n=3)Tab.1 Each batch of low concentrations of residual measurement data(n=3)

續表1

表2 高濃度各批次草魚規格與肌肉中AOZ殘留測定數據(n=3)Tab.2 Each batch of high concentrations of residual measurement data(n=3)

表3 批間差異計算結果(n=6)Tab.3 Interval difference calculation results(n=6)

由表1、2可知，在嚴格控制魚體規格、藥浴時間、水溫的條件下，實際檢測草魚肌肉中AOZ低濃度殘留和高濃度殘留濃度值與預期得到的值存在一定偏差，但是差別不大。根據表中計算的RSD值反應樣品的批間、批內差異性知批內相對標準偏差小于10%，批間相對標準偏差小于15%(表3)，說明樣品批間和批內差異性較小，從而驗證關系式y=0.22x的可行性。

2.4 均勻性和穩定性檢測結果分析

2.4.1 均勻性檢測結果

樣品的均勻性采用單因子方差統計分析進行評定，樣品均勻性檢測數據和統計分析見表4、5。

根據方差分析的原理，通過對組間與組內的均方(MS)比值F與統計檢驗臨界值Fcrit比較，如果F值小于Fcrit，則認為各組測量值之間無系統性差異。由表5方差分析結果表明，F值均小于臨界值Fcrit(9，10)=3.02，P>0.05，表明樣品間不存在顯著性差異，即樣品是均勻性的。

表4 AOZ能力驗證樣品的均勻性檢測數據(n=2)Tab.4 Homogeneity of AOZ proficiency testing samples detected data (n=2)

表5 樣品均勻性檢驗單因子方差分析結果Tab.5 Result of one-way analysis of variance for AOZ homogeneity

2.4.2 穩定性檢測結果

2.3.2.1 短期穩定性

表6是短期穩定測得肌肉中AOZ含量的數據及平均值，將相關數據帶入上述公式計算得到b1、b0、S、S(b1)，線性擬合具體分析結果見表7。查表t0.95,3=3.182，│b1│=0.014 4，t0.95,3·S(b1)=0.040 9，故│b1│

表7 AOZ能力驗證樣品短期穩定數據穩定性分析結果Tab.7 The result analysis of short-term stability of AOZ proficiency sample

2.3.2.2 長期穩定性

表8 AOZ能力驗證樣品長期穩定性檢驗結果(n=6)Tab.8 Long-term stability test results of AOZ proficiency testing samples(n=6)

表9 AOZ能力驗證樣品長期穩定性結果分析Tab.9 The result analysis of long-term stability of AOZ proficiency sample

表8 是AOZ能力驗證樣品長期穩定檢測數據及平均值，將相關數據帶入上述公式計算得到b1、b0、S、S(b1)，線性擬合具體分析結果見表 9。由表 9 可知，│b1│=0.040 3，t0.95，3·S(b1)=0.380 8，故│b1│

3 討論

3.1 藥浴時間對草魚肌肉中AOZ殘留的影響

由圖1可知，隨著藥浴時間的延長，AOZ殘留量逐漸升高，24 h出現峰值，8～18 h出現殘留變化相對平緩的階段，考慮到盡量減少藥浴時間與實驗結果的穩定性，最終確定選擇藥浴時間10 h。并且該曲線的變化趨勢與余孔捷等[15]報道的喹諾酮類多殘留自然基體標準樣品制備中藥浴時間確定的趨勢圖也是一致的。

3.2 溫度對草魚肌肉中AOZ殘留的影響

通過研究不同溫度對草魚肌肉中AOZ殘留影響,結果表明，20 ℃條件下，AOZ在草魚肌肉中富集分布較慢，25 ℃條件下富集分布較快。該結論與Grasset J等[16]研究不同溫度條件下(9、20、28 ℃)金屬(鎘、鎳)在黃鱸腎臟中富集的濃度隨溫度的升高而升高以及與Bj?rklund等[17]報道的不同溫度5、10、16 ℃下土霉素在虹鱒血清中達到峰值的時間分別為24、12和1 h的結論都是一致的。Roberts等[18]認為通常水溫每升高1 ℃，魚類的代謝和消除速度將提高10%。Clarke等[19]人研究發現，熱帶(30 ℃)生活的魚類代謝率大約是極地(0 ℃)生活魚類的6倍。Whitney等[20]研究溫度(23 ℃、30 ℃)對鯊魚代謝率的影響結論也證明了魚體代謝速率隨溫度的升高而加快。以上研究均表明，溫度對水生動物的代謝有很大影響，水溫是給藥時應當考慮的一個重要因素。本研究想達到預期殘留的濃度，20 ℃的水溫條件下需要的藥浴時間更長，綜合考慮，最后確定最佳藥浴溫度為25 ℃。

3.3 y與x相關性驗證

對低濃度組數據運用SPPS 20.0統計軟件進行單樣本t檢驗(參考值為8 μg/kg)得到t值為2.419，P=0.052>0.05，表明在ɑ=0.05顯著水平時，低濃度組數據不存在顯著性差異；對高濃度組數據進行單樣本t檢驗(參考值為25 μg/kg)得到t值為0.604，P=0.572>0.05，表明在ɑ=0.05顯著水平時，高濃度組數據不存在顯著性差異。經t檢驗，高、低濃度殘留組兩組數據均不存在顯著性差異，說明實際得到的數據與預期設定數值8 μg/kg、25 μg/kg不存在顯著性差異，進而說明了關系式y=0.22x的可行性。

3.4 均勻性與穩定性

能力驗證樣品的一致性對進行能力驗證至關重要。在實施能力驗證計劃時，組織方應確保能力驗證中出現的不滿意結果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異性。因此，對于能力驗證樣品的檢測特性量，特別是以活體動物制備的能力驗證樣品，必須進行均勻性檢驗和穩定性檢驗[21]。由上述分析結果可知，制備樣品內和樣品間的均勻性無顯著性差異，在6個月內穩定性合格，滿足能力驗證的要求。

4 結論

本文以草魚為基質，研究了能力驗證樣品制備中溫度、時間與草魚肌肉中最終藥物殘留的濃度關系，結果顯示在魚體規格900～1100 g之間，水溫25 ℃，藥浴10 h的條件下初始藥浴濃度x與草魚肌肉中AOZ殘留濃度y之間的關系為y=0.22x，并且經過多次驗證，也證明了此關系式的正確性。并且運用建立起的關系式y=0.22x，制備出殘留量為10 μg/kg左右的能力驗證樣品，并對樣品的均勻性和穩定性進行評價，經檢測樣品均勻性和穩定性良好，符合能力驗證樣品的要求。