HOTAIR mRNA和EZH 2 mRNA在腎細胞癌組織中的表達情況

吳維

武漢市第一醫院泌尿外科，武漢430022

腎細胞癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，患者早期癥狀不明顯。目前，臨床迫切希望通過相關研究發現腎細胞癌診斷的新靶點和新基因[1]。HOTAIR為同源異形盒（homeobox，HOX）基因家族成員之一，且只存在于哺乳動物的基因組中。HOX基因家族在胚胎發育過程中起著重要作用，HOTAIR為被發現的第一個有反式調節轉錄作用的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。近年來，相關研究顯示，很多惡性腫瘤患者體內均存在HOTAIR異常表達，經過對分子機制和生物學功能的探究發現，HOTAIR對腫瘤的發生、進展均有重要影響，腫瘤轉移和預后與HOTAIR的表達水平緊密相關[2]。EZH2為多梳基因（polycoml group gene，PcG）家族成員之一，而PcG蛋白為基因調控因子，可作用于一些基因的關鍵位點，進而起到調控作用[3]。PcG蛋白可以分成PRC1、PRC2和PRC4等蛋白復合體，而PRC2主要由EZH2組成，可以對H3K27賴氨酸進行介導行甲基化修飾，使下游基因啟動子區的CpG島甲基化，進而實現轉錄抑制與基因沉默，促進腫瘤發展。本研究通過分析HOTAIRmRNA和EZH2mRNA在腎細胞癌組織中的表達情況，旨在為腎細胞癌的診療提供一些新的借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年5月于武漢市第一醫院行手術切除的經病理學檢查確診的61例腎細胞癌患者的腎細胞癌組織存檔標本。所有患者手術前均未接受放化療等治療，其中女性23例，男性38例；平均年齡（58.2±10.7）歲；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移40例；嫌色細胞癌4例，乳頭狀細胞癌19例，透明細胞癌38例。同時選取61例對應的癌旁（距離病灶3 cm以上）正常腎組織標本為對照。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol購自美國SBS公司，無水乙醇購自上海永大公司，總RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，亞硫酸氫鹽購自美國Sigma-Aldrich公司，逆轉錄PCR試劑盒購自美國Foments公司，PCR引物購自美國SBS公司；LXJ-6401型離心機購自北京醫療儀器廠，ELGA PURELAB Ultra型實驗室超純水系統購自英國ELAG LabWater公司，H-1型微型混合器購自上海彭氏公司，5%CO2培養箱購自日本三洋公司，Mastercycler 5333型PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司，XD-10型超凈工作臺購自北京西城半導體設備廠，DYY-Ⅲ2型穩壓穩流電泳儀購自北京六一儀器廠，FOTODYNE型凝膠成像系統購自美國Image公司，DYY-Ⅲ31D型電泳槽購自北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測腎細胞癌組織和癌旁正常腎組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的表達量。首先提取腎細胞癌組織和癌旁正常腎組織的總RNA，鑒定RNA的完整性，進行mRNA反轉錄，cDNA PCR擴增，最后行瓊脂糖凝膠電泳[4]。mRNA相對表達量的判別：使用Gel Pro Analysizer檢測目的基因表達的灰度值，以GAPDH為內參，每個標本重復測定3次，取其平均數值。mRNA的相對表達量=目的基因灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗或單因素方差分析；腎細胞癌組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的相對表達量采用Pearson相關性分析。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中HOTAIR mRNA和EZH 2 mRNA相對表達量的比較

腎細胞癌組織中HOTAIRmRNA、EZH2mRNA的相對表達量均明顯高于癌旁正常腎組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 不同組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 不同組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA相對表達量的比較（±s）

組織類型HOTAIR mRNA EZH2 mRNA

2.2 腎細胞癌組織中HOTAIR mRNA和EZH 2 mRNA表達與腎細胞癌患者臨床特征的關系

不同臨床分期及淋巴結轉移情況腎細胞癌患者的腎細胞癌組織中HOTAIRmRNA和EZH2mRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表2）

2.3 腎細胞癌組織中HOTAIR mRNA與EZH 2 mRNA的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示：腎細胞癌組織中，HOTAIRmRNA與EZH2mRNA的表達水平呈正相關（r=0.683，P﹤0.05）

表2 腎細胞癌組織中HOTAIR mRNA、EZH 2 mRNA表達與腎細胞癌患者臨床特征的關系

3 討論

隨著表觀遺傳學的發展，相關研究顯示，腫瘤的發生、發展過程中會出現很多表觀遺傳學變化。而表觀遺傳學是指基因組序列不發生變化，但基因功能卻發生了改變，其中DNA的組蛋白修飾與甲基化較為常見，兩者均可以使基因的表達量下降，同時DNA序列不發生變化[5-7]。核小體是染色質最基本的單位，由150 bp DNA與8個組蛋白組合而成，組蛋白球體外有DNA纏繞，若DNA對組蛋白的纏繞方式出現變化，其基因表達也隨之變化[8-9]。組蛋白能夠在相關酶的影響下出現不同的修飾過程，如乙酰化、甲基化等，稱作組蛋白修飾。EZH2為組蛋白H3K27甲基化酶，相關研究顯示，EZH2mRNA在前列腺癌中呈高表達，還有研究表明，EZH2不僅具有組蛋白甲基轉移酶的活性，還具有組蛋白乙酰轉移酶的活性，對靶基因甲基化進行調控，對基因沉默產生介導作用，可參與某些癌基因的轉錄抑制[10-11]。EZH2有可能成為乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的標志物應用于腫瘤診療等方面。HOTAIR能夠與PRC2復合體相結合，對HOXD位點的轉錄抑制進行介導，而PCR2復合體的主要亞基為EZH2[12-13]。

本研究結果顯示，不同臨床分期及淋巴結轉移情況腎細胞癌患者的腎細胞癌組織中HOTAIRmRNA、EZH2mRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。目前，腎細胞癌的主要治療方式為外科手術，放化療等輔助治療手段對腎細胞癌患者無明顯療效，而分子靶向治療為腎細胞癌患者提供了新的治療方向[14]。Kleer等[15]研究表明，EZH2有組蛋白乙酰轉移酶活性，所以組蛋白乙酰轉移酶抑制劑能夠對EHZ2的活性產生抑制，有可能會是治療腫瘤較為有效的藥物。lncRNA作為轉錄副產物分子，缺少深入探究，而HOTAIR則是腫瘤和其他疾病間有重要聯系的分子之一。相關研究顯示，PRC2復合體與HOTAIR結合以后，能經過調控機理對860多個基因位點產生影響，對下游基因表達產生抑制。本研究結果顯示，腎細胞癌組織中HOTAIRmRNA與EZH2mRNA的表達呈正相關，當HOTAIR基因的表達水平升高時，EZH2基因的表達水平也有升高趨勢。

綜上所述，HOTAIRmRNA和EZH2mRNA在腎細胞癌組織中的表達水平均明顯高于癌旁正常腎組織；檢測腎細胞癌患者的HOTAIR、EZH2水平，對其腫瘤惡性程度的判斷有重要參考價值。