KISS 1蛋白在轉移性胃癌中的表達及其與患者臨床特征和預后的關系

楊安，沈艷峰

1邯鄲市中心醫院普外科，河北 邯鄲056001

2河北工程大學附屬醫院腫瘤科，河北 邯鄲0560020

雖然近年來胃癌總體的發病率和病死率逐漸下降，但轉移性胃癌（metastatic gastric cancer，MGC）的發病率卻明顯上升，約占新發胃癌病例的40%[1]。MGC處于腫瘤晚期，患者的全身性并發癥較多，5年生存率不到5%，即使行全身系統性化療，其中位生存時間也僅12個月左右，預后極差[2-3]。惡性腫瘤具有侵襲和轉移的生物學特性，是引起腫瘤相關死亡的主要原因。作為一種腫瘤轉移抑制基因編碼的蛋白質，KISS1蛋白抑制腫瘤浸潤轉移的作用正逐漸受到重視。研究表明，KISS1蛋白在人體多種惡性腫瘤中發揮腫瘤轉移抑制作用[4-5]。KISS1基因是由Lee和Welch[6]首次在人類黑色素腫瘤細胞中分離出的一種含4個外顯子的cDNA片段，定位于1號染色體長臂lq32-q41區，其羧基末端（61～121）含有54個氨基酸的殘基肽是人孤兒G蛋白偶聯受體的內源性配體，稱為轉移抑素（metastin），其與G蛋白偶聯受體54（G-protein coupled receptor 54，GPR54）結合可使細胞內磷脂酶-c介導的ERK等信號轉導途徑激活，從而抑制腫瘤細胞趨化、增殖及轉移，并促進細胞凋亡[7-8]。關于KISS1蛋白與MGC侵襲轉移關系的研究，國內外鮮有報道。本研究通過免疫組織化學方法檢測胃癌組織及癌旁組織中KISS1蛋白的表達水平，分析KISS1蛋白與MGC患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2015年6月邯鄲市中心醫院收治的63例MGC患者手術切除的胃癌組織及其中50例癌旁組織（距陰性切緣＞5 cm，經病理證實為正常胃黏膜組織）標本，另收集同期60例非轉移性胃癌（non-metastatic gastric cancer，NMGC）患者手術切除的胃癌組織標本。MGC患者中，腹膜、大網膜轉移34例，肝轉移11例，鎖骨上及腹膜后等遠處淋巴結轉移19例。納入標準：①均因梗阻、出血或穿孔等原因行姑息性胃切除術；②術后病理學檢查確診為胃癌，轉移灶經病理學檢查證實源于胃癌；③術前均未接受腫瘤相關治療；④具有完整的臨床資料及隨訪資料。

1.2 試劑

兔抗人KISS1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

將采集的組織標本切成1 cm3小塊，以10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，按4 μm厚連續切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin perosidase，SP）法進行染色，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，以已知KISS1陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定

KISS1免疫組化產物為定位于腫瘤細胞細胞質內的棕黃色細顆粒。采用半定量分析方法[9]，根據陽性細胞所占百分比計分，陽性細胞百分比﹤10%計1分，陽性細胞百分比為10%～50%計2分，陽性細胞百分比﹥50%計3分；根據染色程度計分，無色為0分，淡黃色為1分，中度黃色為2分，棕褐色為3分。染色強度與陽性細胞百分比計分的乘積≥3分為陽性，﹤3分為陰性。免疫組化結果由2位經驗豐富的病理醫師通過雙盲法獨立判定。

1.5 隨訪

采用門診、電話等方式進行隨訪，隨訪截至2017年10月，隨訪時間為4～48個月，中位隨訪時間為20個月。術后復發轉移主要經CT、MR及PET-CT等檢查明確，無瘤生存期定義為術后至復發轉移或隨訪截止時間。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP法檢測各組KISS 1蛋白的表達情況

KISS1蛋白表達于腫瘤細胞的細胞質中。MGC、NMGC及癌旁組織中KISS1蛋白的陽性表達率分別為23.8%（15/63）、43.3%（26/60）和82.0%（41/50），3者比較，差異有統計學意義（χ2=38.468，P﹤0.05）。其中，MGC組織和NMGC組織中KISS1蛋白的陽性表達率均低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.05）；MGC組織和NMGC組織中KISS1蛋白的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。

2.2 MGC組織中KISS 1蛋白表達與臨床特征的關系

MGC組織中KISS1蛋白的陽性表達率與胃癌大體類型、有無脈管癌栓及浸潤深度有關（P﹤0.05）；而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平的MGC患者胃癌組織中KISS1蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 MGC組織中KISS 1蛋白表達與患者臨床特征的關系（ n=63）

2.3 MGC組織中KISS 1蛋白表達與預后的關系

63例MGC患者均獲得術后隨訪。MGC患者的生存時間為4～27個月，中位總生存時間為8個月，1年生存率為25.4%（16/63），詳見圖1。Kaplan-Meier生存分析顯示，KISS1蛋白陽性表達MGC患者的中位生存時間為13個月，1年生存率為53.3%（8/15）；而KISS1蛋白陰性表達MGC患者的中位生存時間為8個月，1年生存率為16.7%（8/48）；兩者的總體生存情況比較，差異有統計學意義（χ2=6.290，P=0.012），詳見圖2。將MGC患者的臨床特征及KISS1蛋白表達情況納入Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，結果顯示，KISS1蛋白陽性表達是影響MGC患者預后的保護因素（HR：0.442，95%CI：0.239～0.818，P=0.009）。

圖1 63例MGC患者的生存曲線

圖2 KISS 1蛋白陽性表達（ n=15）與陰性表達（ n=48）MGC患者的生存曲線

2.4 NMGC組織中KISS 1蛋白表達與術后復發轉移的關系

60例NMGC患者中，50例患者獲得術后隨訪，其中KISS1蛋白陽性表達23例，陰性表達27例。KISS1蛋白陽性表達NMGC患者的中位無瘤生存時間為27個月，1、2、3年無瘤生存率分別為95.7%、60.3%及43.5%；KISS1蛋白陰性表達NMGC患者的中位無瘤生存時間為16個月，1、2、3年無瘤生存率分別為70.4%、20.8%及15.6%。KISS1蛋白陽性表達和陰性表達NMGC患者的1、2、3年無瘤生存率比較，差異均有統計學意義（χ2=4.345，P=0.037；χ2=18.123，P﹤0.01；χ2=14.772，P﹤0.01）。KISS1蛋白陽性表達和陰性表達NMGC患者的總體無瘤生存情況比較，差異有統計學意義（χ2=12.176，P﹤0.01）。（圖3）

圖3 KISS 1蛋白陽性表達（ n=23）與陰性表達（ n=27）NMGC患者的無瘤生存曲線

3 討論

侵襲與轉移是胃癌的重要生物學特征，MGC患者因其腫瘤細胞的高度轉移特性，預后極差。胃癌的轉移是多基因調控的復雜過程，研究相關基因在胃癌轉移中的調控機制，抑制胃癌的惡性轉化及轉移，對提高患者的生存率具有重要意義[10]。腫瘤轉移抑制基因KISS1在阻斷惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉移中的作用正受到眾多學者的青睞。Lee和Welch[6]的研究首先證實KISS1為腫瘤轉移抑制基因。之后Kostadima等[11]的研究顯示，KISS1基因編碼的KISS1蛋白可以影響腫瘤細胞的分化和增殖，促使其凋亡。而KISS1蛋白抑制腫瘤浸潤和轉移的機制包括調控腫瘤信號轉導通路和腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞遷移，改變腫瘤細胞的黏附性、化學趨向性和減少腫瘤集落形成等[10,12-15]。

KISS1蛋白在胃癌中的陽性表達率低或呈缺失性表達，對胃癌浸潤轉移起重要作用，并影響預后。周蕾等[16]研究發現，KISS1蛋白在胃腺癌中的陽性表達率為45.2%，而在正常胃黏膜中的陽性表達率卻高達87.5%，進一步研究發現，隨著KISS1蛋白表達率的降低，胃癌的浸潤越深，腫瘤分期越高，淋巴結越易于轉移；其研究結果表明KISS1蛋白表達的缺失或低表達導致其抑制腫瘤細胞運動的能力降低，從而促進腫瘤細胞的侵襲和運動，最終導致胃癌浸潤和轉移。Guan-Zhen等[17]研究報道，KISS1蛋白在肝轉移和（或）淋巴結轉移組織中的陽性表達率低于原發胃癌組織，提示KISS1蛋白在胃癌浸潤轉移過程中發揮著重要的抑制作用。另有學者認為，KISS1蛋白的表達與胃癌的浸潤深度和淋巴結轉移情況呈負相關[18]。表明KISS1蛋白的表達缺失或低表達與惡性腫瘤的發生有關，可能是導致胃癌轉移的重要因素。Dhar等[19]通過核酸酶保護分析法測定胃癌組織中KISS1蛋白的表達水平，結果發現，低表達組較高表達組患者具有更高的脈管侵犯率、遠處轉移率和復發率，且總生存率和無瘤生存率較低（P﹤0.01）。惠菲菲等[20]的研究結果顯示，同時性結直腸癌肝轉移（colorectalcancerwith synchronouslivermetastases，sCRLM）患者中，KISS1蛋白陽性表達的患者術后生存率優于陰性表達者。

本研究探討了KISS1蛋白在MGC、NMGC及癌旁組織中的表達情況，以研究KISS1蛋白在胃癌轉移中的作用及對MGC患者預后的影響，其研究結果與上述研究結果基本一致：KISS1蛋白在癌旁組織、NMGC組織和MGC組織中的表達逐漸減少，3組比較，差異有統計學意義（P﹤0.05），值得探討的是，雖然MGC組織中KISS1蛋白的陽性表達率較NMGC組織低，但組間比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），提示胃癌在發生轉移前病變階段KISS1蛋白已經出現表達下調，組間比較差異無統計學意義可能是由于樣本量不足所致，需要擴大樣本量進一步驗證。

本研究結果還顯示，腫瘤浸潤程度深、存在脈管癌栓及浸潤型癌等高危因素的MGC患者胃癌組織中的KISS1蛋白陽性表達率低，生存分析顯示，KISS1蛋白陽性表達患者的生存時間長于陰性表達的患者，差異有統計學意義（P﹤0.05），說明KISS1蛋白的低表達或缺失在一定程度上影響MGC患者腫瘤細胞的發生發展及浸潤轉移，且可作為MGC患者預后不良的指標[12,21-22]。本研究結果顯示，NMGC患者中KISS1蛋白陰性表達者術后復發轉移率高，無瘤生存期短，進一步印證了KISS1是腫瘤轉移抑制基因，在胃癌的發展、侵襲及復發轉移過程中發揮抑制腫瘤轉移的作用，其表達缺失或下調可以成為判斷腫瘤侵襲轉移特性的重要生物學指標，對臨床制定個體化治療方案、判斷術后無瘤生存期及預后有一定的指導意義。

綜上所述，KISS1蛋白在MGC患者的胃癌組織中陽性表達率低，腫瘤進展快，預后差。KISS1蛋白在胃癌的發展、侵襲及轉移過程中發揮重要作用，可以作為判斷腫瘤惡性程度的重要生物學指標，同時，KISS1蛋白有望成為預后預測的標志物，后續可研究KISS1蛋白是否可作為靶點對MGC患者進行基因治療。