產胞外多糖乳酸菌的選育

仝雪 曹珂珂 趙祝福

摘 要：為了篩選高產胞外多糖的乳酸菌，從酸奶、奶酪中通過富集和分離得到7株乳酸菌，以菌落拉絲實驗為初篩指標和苯酚-硫酸法測胞外多糖產量的復篩方法得到1株高產胞外多糖乳酸菌的優良菌株YL2。并且對YL2菌株進行培養特征、個體形態特征和生理生化鑒定試驗，初步確定YL2為乳桿菌屬（Lactobacillus），其胞外多糖的產量為430.0mg/L。

關鍵詞：乳酸菌；胞外多糖；選育；鑒定

中圖分類號 Q935 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）13-0013-03

Abstract：In order to screen high-producing extracellular polysaccharide lactic acid，bacteria，seven strains of lactic acid bacteria were obtained from yoghurt and cheese by enrichment and separation.The screening test was performed using the colony wire drawing test and the screening method for extracellular polysaccharide production by the phenol-sulfuric acid method.One high-yield extracellular polysaccharide lactic acid bacteria was obtained which the strain was YL2.The culturing characteristics，morphological characteristics，physiological and biochemical identification tests of YL2 strain were carried out，and YL2 was preliminarily identified as Lactobacillus.The extracellular polysaccharide yield was 430.0 mg/L.

Key words：Lactic acid bacteria；Exopolysaccharides；Breeding；Identification

微生物胞外多糖是在微生物生長和代謝的過程中產生并且分泌到細胞外，常常滲透于周圍空間和培養基中的一類多糖化合物。在自然環境中，微生物胞外多糖的存在起著保護菌株的作用[1-2]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長過程中分泌出的一種特殊水溶性多糖物質[3]，是一種天然的高分子聚合物。從奶及奶制品中選育出的乳酸菌，可增稠奶制品，賦予奶制品良好的穩定性、風味和口感，使奶制品看起來細膩潤滑、口味獨特等[4]，并且它還具有良好的生理功效。目前，酸乳發酵的菌株產多糖的量較低，遠不能滿足生產所需[5]，因此，選育高產胞外多糖乳酸菌并優化產胞外多糖的工藝條件等仍是當下的重點。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料與試劑 酸奶、奶酪、泡菜、MRS肉湯培養基、脫脂乳培養基等。

1.1.2 主要儀器設備 顯微鏡、微生物培養箱、高速離心機、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、低溫冰箱、超純水系統等。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的富集與分離 分別選取10mL的酸奶、奶酪和泡菜，接種于裝有100mL的MRS肉湯培養基中，37℃恒溫培養48～72h。取富集后的培養液1mL加入9mL無菌水，依次進行10倍梯度稀釋至10-6，分別吸取-5、-6這2個稀釋度的菌懸液0.05mL涂布于加有1%CaCO3的MRS平板上，每個稀釋度做3個平行，37℃恒溫培養24h左右。觀察并記錄菌落特征，選擇有明顯溶鈣圈的菌落進行下一步實驗。

1.2.2 乳酸菌的純化和初步鑒定 為了獲得純培養物，選擇溶鈣圈明顯的菌落在MRS平板上反復的劃線直至得到單菌落。對純化后的單菌落進行革蘭氏染色實驗以及過氧化氫酶試驗，在試驗結果中顯紫色，G+，過氧化氫酶實驗為陰性的菌株可以初步判斷為乳酸菌。4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 產胞外多糖乳酸菌的初篩 由于培養的乳酸菌的菌落粘度、外力拉絲度和它本身生產出的多糖產量呈正線性關系[5-6]，因此用菌落外力作用下的粘度大小可以作為乳酸菌胞外多糖產量高低的根據，將分離純化的乳酸菌在MRS培養基上劃線分離，37℃培養48h后，用無菌牙簽向上拉伸，通過測量，選擇菌落粘度大、拉絲長度較大的進行復篩實驗。

1.2.4 產胞外多糖乳酸菌的復篩 （1）胞外多糖的提取：參考張玉龍[7]的方法，20mL、37℃培養24h的菌懸液，6000r/min離心20min，在離心后的上清液中加入10mL的TCA溶液，4℃靜置12h，后6000r/min離心20min，取上清液加入透析袋中，4℃透析24h，再加入3倍體積的95%vol乙醇，4℃靜置過夜，再次6000r/min離心15min，除去上清液，即得沉淀后的胞外多糖，備用。（2）胞外多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法，參照張惟杰[8]的做法，以葡萄糖制作標準曲線測定菌株的胞外多糖產生量。

1.2.5 產胞外多糖菌株的鑒定[9] 個體形態和菌落形態的培養與觀察；生理生化鑒定：對產胞外多糖乳酸菌進行H2O2的測定實驗、牛奶反應、V-P試驗、H2S的產生試驗和菌株生長條件的實驗等。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化 從酸奶、奶酪和泡菜中富集分離得到多種菌株，將有明顯溶鈣圈而且乳酸菌的菌落特征特典型的菌落選出來，再對這些菌落反復劃線進行純化，觀察這些菌落的形態特征。其中G+、過氧化氫酶陰性，而且沒有芽孢的菌株初步判定為乳酸菌，挑選7株菌株保存。

2.2 產胞外多糖乳酸菌的初篩 對7株乳桿菌進行初篩拉絲實驗，選出相對較優的3株分別為MN1、YL2和PC2，如圖1所示。

2.3 產胞外多糖乳酸菌的復篩 葡萄糖標準曲線為y=2.0025x+0.0206，R2=0.9947。通過苯酚-硫酸法測得MN1、YL2和PC2乳酸菌的胞外多糖產量分別為272.42mg/L、430.00mg/L、357.83mg/L，其中編號為YL2的菌株在MRS肉湯培養基中的EPS產量最高，選定為目的菌株。

2.4 產胞外多糖乳酸菌的鑒定 （1）菌落觀察菌株YL2在MRS培養基上的菌落為圓形，乳白色，邊緣整齊，濕潤、有光澤，不透明，較粘稠，易挑起。（2）細胞形態觀察 在顯微鏡下觀察該菌株，為長桿狀或短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性，紫色。（3）生理生化實驗結果。

由表1可知，運動性實驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖酸鹽產氣、明膠液化試驗、硫化氫試驗結果均為陰性，說明YL2乳酸菌不運動、不產氣、明膠不液化和無H2S氣體產生；淀粉水解、牛奶試驗等為陽性；由表2可知，該菌株可以利用葡萄糖和乳糖等，不利用半乳糖、麥芽糖等；由表3可知，YL2乳酸菌在耐鹽實驗中，NaCl濃度為2%、5%的固體培養基上均有生長，濃度越大菌落數越少，7%濃度下不生長；YL2乳酸菌在耐酸堿實驗中，在pH4.5和6.0條件下生長，在pH7.5時不生長；YL2乳酸菌在溫度梯度實驗中，在35℃培養下的菌長勢最好，10℃時生長緩慢。

根據上述形態特征觀察、生理生化實驗、糖發酵實驗和菌種生長條件實驗并對照《乳酸細菌分離鑒定及實驗方法》[10]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]初步鑒定出YL2菌株為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

3 結論

通過富集、劃線分離從酸奶中分離純化出7株乳酸菌，采用初篩的菌落拉絲法測其粘度和復篩測其胞外多糖的產量，從7株乳酸菌中篩選出1株高產胞外多糖菌株YL2，其EPS產量為430.0mg/L。根據培養特征、形態特征和生理生化特征初步鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

參考文獻

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[11]BUCHNAN R，GIBBONS E.伯杰氏鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1984. （責編：張宏民）