蓮藕渣多糖的單糖組分測定

孫豐婷,孫風光，李威

(1.揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127;2.江蘇中譜檢測有限公司，南京 210061;3.淮陰師范學院 生命科學學院，江蘇 淮安 223300;4.山東畜牧獸醫學院，山東 濰坊 261000)

蓮藕是一種藥食同源的蔬菜，有緩解疲勞、延緩衰老的作用[1]。在利用蓮藕生產藕粉、藕汁的過程中會產生大量的蓮藕渣，蓮藕渣中含有多種生物活性物質，如多糖、多酚、膳食纖維等[2]。蔡寶玉等[3]利用蓮藕渣做成食品添加成分，添加到飲料、面包、餅干等食品中。嚴浪等[4]從蓮藕渣中提取水不溶性膳食纖維和水溶性多糖，并對不溶性膳食纖維的特性和水溶性多糖的結構進行了初步研究，研究結果表明：水提醇沉法可制得蓮藕渣中的粗多糖，且得率為2.50%。孫杰等[5]利用響應面法對蓮藕多糖的提取工藝進行了優化，并初步探索了蓮藕多糖的理化特性，實驗結果表明：提取溫度為89 ℃，均質轉速為11800 r/min，提取時間為121 min時，多糖得率為5.88%。蓮藕多糖含量豐富，具有多種生物活性功能。許瑞波等[6]利用正交實驗優選藕節多糖的提取工藝，研究結果表明：提取時間3 h，料液比1∶30，浸提時間60 min，90 ℃下提取2次，藕節多糖的提取率為4.36%。Mkadmini H K 等[7]利用響應面法優化了從蓮藕中提取多糖的工藝，并研究了多糖的成分和抗氧化活性。Braz R等[8]從蓮藕中提取多糖，并對其結構進行了修飾。

實驗以蓮藕渣為研究對象，利用氣相色譜法測定蓮藕渣多糖的單糖組成，從而為蓮藕渣的研究、綜合利用及開發新的天然功能性多糖提供新的資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮藕渣：耐高溫α-淀粉酶(BR) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；95%乙醇(AR)、鹽酸羥胺(AR)、吡啶(AR) 國藥集團化學試劑有限公司；乙酸酐(AR)、三氯乙酸(AR) 上海凌峰化學試劑有限公司；三氯甲烷(AR)、三氟乙酸(CP) 南京化學試劑有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋(HH-8) 江蘇金壇市億通電子有限公司；減壓旋轉蒸發儀(IKA RV10) 艾卡儀器設備有限公司；氣相色譜儀(7890A) 安捷倫科技有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；冷凍干燥機(ALPHA 1-2)。

1.3 方法

1.3.1 蓮藕渣多糖的提取[9-10]

準確稱取10 g蓮藕渣，料液比為1∶30 (m/V)加入超純水，加入耐高溫α-淀粉酶100 μL，于水浴溫度60 ℃預處理1 h，90 ℃提取3 h，4000 r/min離心10 min取上清液。離心后的沉淀再以料液比為1∶30 (m/V)加入超純水，90 ℃、3 h二次提取，4000 r/min離心10 min得上清液。合并2次上清液，濃縮至一定體積，加入3倍體積95%乙醇沉淀過夜，離心收集多糖沉淀。Sevag法去蛋白后，透析48 h，冷凍干燥得粗多糖。

1.3.2 蓮藕渣多糖的純化

先利用DEAE纖維素-52色譜柱，以0.3，0.5 mol/L的NaCl溶液為洗脫液，以2 mL/min的流速依次進行梯度洗脫，再利用Sephadex G-100色譜柱，用超純水以0.3 mL/min的流速洗脫，在波長490 nm處采用硫酸-苯酚法檢測多糖濃度變化，并繪制多糖洗脫曲線。

1.3.3 蓮藕渣多糖的水解

準確稱取10 mg的蓮藕渣多糖于玻璃試管中，加入4 mol/L的三氟乙酸5 mL，沸水浴水解8 h，取出，濃縮蒸干備用。

1.3.4 蓮藕渣多糖的衍生化[11,12]

準確稱取10 mg樣品多糖，加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL的吡啶，混勻，90 ℃水浴30 min。取出，冷卻至室溫后加入0.5 mL的乙酸酐，90 ℃水浴30 min，進行乙酰化反應。反應完成后將產物減壓蒸干，再加入2 mL三氯甲烷溶解。取1 μL進樣，進行測定。

1.3.5 標準單糖的衍生化

準確稱取各標準單糖，按1.3.4操作進行衍生化。

1.3.6 色譜柱條件

色譜柱：HP-5(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，柱溫：初始溫度155 ℃，以0.4 ℃/min升溫至160 ℃，2 min后以0.1 ℃/min升溫至162 ℃，再以3 ℃/min升溫至169 ℃，最后以0．2 ℃/min升溫至171 ℃；N2作為載氣；進樣溫度為255 ℃；進樣方式：分流(分流比15∶1)檢測器：FID為255 ℃(氮氣體積流量25 mL/min，氫氣體積流量30 mL/min，空氣體積流量400 mL/min)，進樣量：1.0 μL。

2 結果與分析

2.1 蓮藕渣多糖的得率和純化

利用水提醇沉法得到蓮藕渣粗多糖LRP，得率為2.68%；經DEAE纖維素-52色譜柱及Sephadex G-100色譜柱分離純化得蓮藕渣多糖LRP1和LRP2，見圖1。

圖1 LRP在不同鹽濃度下的洗脫曲線Fig.1 Elution profile of LRP at different salt concentration

2.2 蓮藕渣多糖的單糖組成

圖2 單糖標品混合樣的GC圖譜Fig.2 GC profiles of mixed monosaccharides standards

注：1為鼠李糖；2為巖藻糖；3為阿拉伯糖；4為木糖；5為甘露糖；6為葡萄糖；7為半乳糖，8為肌醇。

圖3 蓮藕渣多糖樣品中各單糖的GC圖譜Fig.3 GC profiles of monosaccharides from LRP

注：1為鼠李糖；2為巖藻糖；3為阿拉伯糖；4為木糖； 5為葡萄糖；6為半乳糖。

由圖2和圖3可知，蓮藕渣多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和巖藻糖組成，各單糖的摩爾比見表1。其中半乳糖含量最多，木糖含量最少。

表1 蓮藕渣多糖中單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of LRP

3 結論

利用水提醇沉法分離得到的蓮藕渣粗多糖的得率為2.68%，經純化后的多糖LRP1和LRP2，其單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和巖藻糖，且主要組成成分為半乳糖和阿拉伯糖。