黑蒜加工中類黑精相關成分變化及其組成分析

楊慶麗，董艷，劉玉，石杰，姬妍茹

(黑龍江省科學院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

黑蒜是生大蒜在變溫條件下加工生產的一種新型健康食品，成品黑蒜顏色黑亮，口味酸甜。其顏色變化的主要原因是生成了大量的類黑精。類黑精是美拉德反應過程中還原糖等的羧基與氨基酸等的游離氨基之間發(fā)生縮合生成一種棕褐色甚至黑色的大分子化合物[1]。研究表明：類黑精具有抗氧化、降糖、降血壓、防齲齒等功效，其抗氧化強度甚至與目前食品中常用的抗氧化劑維生素C相媲美[2]。目前普遍認為類黑精是一類具有相似荷質比，結構非常接近的復雜混合物[3]。如劉亞玲等[4]的研究表明：咖啡類黑精成分非常復雜，最多的為棕櫚酸和硬脂酸，其次是胺類、酯類、酚類、吡咯類、呋喃類、吡啶類、醛類、醇類、酮類等。類黑精的形成受較多因素的影響，反應體系的底物是其中極其重要的因素[5]。因此，本研究對黑蒜加工過程中與類黑精形成相關的還原糖、總糖、氨基酸及5-HMF變化進行分析。同時采用Py-GC-MS技術分析黑蒜類黑精組成，為美拉德反應中呈色物質的形成機理提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生大蒜：北京華聯(lián)超市；5-羥甲基糠醛標準品(≥98%)：北京中科儀友化工技術研究院；DNS試劑：自配；其他試劑：均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Master-D UF實驗室超純水機 上海和泰儀器有限公司；UV765紫外可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Epoch酶標儀 美國BioTek公司；LC-15C高效液相色譜儀 日本島津公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；ISQ LT GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo公司；臺式高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖粗提液的制備

黑蒜含糖量較高、難以烘干。因此，以下試驗中生大蒜及黑蒜重量為根據(jù)含水量折合后的干重。水分測定采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法。

取不同加工時間點黑蒜樣品各1 g分別加入2 mL滅菌蒸餾水，浸泡3 h后充分研磨，加入滅菌蒸餾水8 mL沸水煮20 min，80 ℃，150 W超聲提取30 min，定容至10 mL，10000 r/min離心15 min后上清即為糖粗提液。

1.3.2 還原糖及總糖的測定

取糖粗提液，DNS法[6]和苯酚-硫酸法測定還原糖及總糖含量[7]，以果糖計。以等體積糖粗提液不加顯色劑直接定容至刻度為本底色，酶標儀測定前所有樣品反應液需9000 r/min離心15 min取上清。

1.3.3 總氨基酸的測定

黑蒜總氨基酸測定參考了董愛榮等[8]的方法；取不同加工時間黑蒜樣品各100 mg研磨后加入15 mL滅菌蒸餾水，50 ℃超聲30 min，加入15 mL濃HCl，氮吹儀30 min，105 ℃水解24 h。14000 r/min離心10 min，取上清3 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后以0.02 mol/L鹽酸溶解定容至10 mL。0.22 μm水膜過濾后氨基酸分析儀上樣20 μL測總氨基酸量。

1.3.4 5-羥甲基糠醛(5-HMF)分析

5-HMF含量根據(jù)NY/T 1332-2007中樣品處理及液相條件測定[9]。色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇+水(15%+85%)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL。標準曲線方程為y=7583x+4701，R2=0.997。

1.3.5 黑蒜類黑精的制備

根據(jù)類黑精易溶于水而不溶于乙醇的特性，本研究參考了嚴昊[10]的提取方法。取成品黑蒜50 g，加入150 mL滅菌蒸餾水浸泡24 h，10000 r/ min離心15 min取上清，加入2.5倍體積(V/V)的無水乙醇，10 h后棄上清，再加入約2倍體積(V/V)的無水乙醇，搖勻后二次醇沉3 h，棄上清，揮干乙醇得類黑精。

1.3.6 黑蒜類黑精Py-GC-MS分析

類黑精Py-GC-MS反應條件參考了劉亞玲等的方法。稱取黑蒜類黑精0.5 mg，包裹于鐵磁體的熱箔片中，在450 ℃條件下裂解后進樣分析。

Py條件：熱裂解溫度450 ℃，熱裂解時間10 s。

GC條件： J & W DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；分析采用一級程序升溫，初始溫度60 ℃，保持5 min，以30 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min；載氣為氦氣；流量為25 mL/min。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度 270 ℃；離子源溫度220 ℃；掃描時間0.2 s；質量掃描范圍50～400 m/z。面積歸一化法確定主要裂解產物的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007及Graphpad Prism 5進行作圖及差異顯著性分析。p<0.05為差異顯著，p>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 黑蒜加工中顏色變化

圖1 黑蒜加工中顏色變化Fig.1 Color changes of black garlic during processing

由圖1可知，隨著加工進行，黑蒜顏色逐漸加深，由1 h的乳白色變?yōu)?60 h的黑色。圖1中各加工時間點含水量分別為64.56%，63.66%，63.62%，68.54%，61.87%，57.62%，61.11%，48.32%，40.04%，38.49%，40.04%，37.63%。

2.2 還原糖及總糖含量

大蒜中糖含量豐富，主要是果糖、葡萄糖和半乳糖[11]，這些糖能夠為黑蒜類黑精的生成提供物質基礎。

圖2 不同加工時間還原糖及總糖含量分析(干重)Fig.2 Analysis of reducing sugar and total sugar at different processing time (dry weight)

由圖2可知，黑蒜加工過程中總糖含量在0，360 h分別為444.85，351.52 mg/g，整體呈下降趨勢；其中0～24 h趨于穩(wěn)定(p>0.05)；12，24，72，120 h分別為481.79，466.18，397.09，371.88 mg/g，顯著下降(p<0.05)；之后保持穩(wěn)定(p>0.05)。有研究表明，美拉德反應中，果糖能夠與氨基酸反應生成焦糖香物質[12]。因此，總糖含量降低可能與黑蒜加工中果糖等參與美拉德反應生成了類黑精有關。還原糖含量變化總體趨勢為先上升后穩(wěn)定；其中0～24 h含量無顯著變化(p>0.05)；24，72，120，168 h分別為23.80，42.36，48.78，62.28 mg/g，顯著升高(p<0.05)；之后趨于穩(wěn)定(p>0.05)；360 h顯著高于0 h(p<0.05)。由以上結果可知12，24，72，120，168 h是糖變化的關鍵點，這些節(jié)點應該與黑蒜口味生成相關。

2.3 氨基酸組成及含量

表1 不同加工時間總氨基酸含量分析(干重)Table 1 Analysis of total amino acid content at different processing time (dry weight)

注：*為必需氨基酸。

由表1可知，黑蒜中共檢測出13種氨基酸，其中4種為必需氨基酸，除組氨酸基本無變化外(p>0.05)，其他氨基酸在整個加工過程中均呈逐漸降低趨勢。原因是氨基酸合成類黑精的同時加熱分解生成了呋喃和吡啶等物質。其中降幅最大的為精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸(p<0.05)，分別為97.5%，85.1%，75.4%，75.1%，這幾種氨基酸為參與美拉德反應的主要氨基酸。很多研究中以賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸為基礎建立美拉德反應模型[13,14]。秦禮康等[15]的研究表明，形成類黑精的主要氨基酸殘基是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸。由此可知，參與美拉德反應從而生成類黑精等呈香、呈色物質，可能是黑蒜加工中大多數(shù)氨基酸含量降低的主要原因。

2.4 5-HMF含量分析

5-HMF是類黑精形成的中間產物，食品加工中，美拉德反應以及糖類的受熱分解都會大量產生[16]。大蒜中糖含量豐富能夠為5-HMF的生成提供物質基礎。

圖3 5-HMF含量變化(干重)Fig.3 Changes of 5-HMF content (dry weight)

由圖3可知，黑蒜加工過程中，5-HMF含量整體呈先升后降的趨勢。其中0～72 h含量基本穩(wěn)定；72～216 h含量顯著升高(p<0.05)，分別為1.89,3.21,4.62,5.40 mg/g，之后穩(wěn)中有降，360 h時為4.41 mg/g。這是由于隨著加工進行5-HMF作為類黑精的中間產物，逐漸消耗生成了終產物類黑精。目前對于5-HMF的安全性仍存在爭議。有研究認為，5-HMF能夠造成DNA損傷[17]；有些人則認為5-HMF沒有嚴重的健康危害，研究表明：通過各種動物實驗證明5-HMF有足夠大的安全限度，每天攝入量在80～100 mg/kg體重范圍內無不利影響[18]。有報道稱5-HMF具有抗氧化、改善血液流變學等對人體有益的生物活性[19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)黑蒜中5-HMF臍靜脈內皮細胞有抗炎癥的作用[20]。在醫(yī)藥領域，以5-HMF為有效成分的心血管藥物已申請相關專利[21]。因此，5-HMF的相關研究仍需繼續(xù)深入進行。

2.5 黑蒜類黑精Py-GC-MS分析

黑蒜提取類黑精，通過Py-GC-MS分析，在450 ℃裂解溫度條件下得到總離子流圖，見圖4。

圖4 黑蒜類黑精裂解總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatograms of black garlic melanoidins

黑蒜類黑精熱裂解產物見表2。

表2 黑蒜類黑精熱裂解產物(>60.0%)Table 2 Pyrolysis products of black garlic melanoidins(>60.0%)

黑蒜類黑精裂解產物共115種，匹配度大于60%的27種，其中呋喃類11種，相對含量為46.08%；噻吩類3種，相對含量為2.42%；烷烴1種，相對含量為2.26%；吡咯類4種，相對含量為1.81%；酚類2種，相對含量為0.51%。

呋喃、吡咯及其衍生物，在大多數(shù)熱加工食品中普遍存在。被認為是美拉德反應的特征產物，共同影響著熱加工食品的風味[22]。還原糖在偏酸環(huán)境下會脫羥基環(huán)化生成如糠醛、糠醇、乙?；秽?、甲基呋喃等呋喃類產物[23]。黑蒜類黑精中含量最高的呋喃類是3-甲基呋喃、2，5-二甲基呋喃和5-羥甲基糠醛，相對含量分別為26.82%,14.59%,1.42%，黑蒜加工中還原糖含量逐漸降低，與類黑精中呋喃相對含量較高是相符的。吡咯類相對含量分別為吡咯1.03%、1-氫-3-甲基吡咯0.11%、2-乙?；量?.26%；噻吩是肉類及植物油中常見的揮發(fā)性風味物質[24]，黑蒜加工中，大蒜中硫醚化合物的不穩(wěn)定鍵受到高溫加熱而斷裂形成噻吩，噻吩賦予黑蒜香甜味[25]。黑精中噻吩、四氫噻吩和2-羰基三氫噻吩相對含量分別為2.01%,0.31%，0.10%。黑蒜類黑精其他組成物質包括酸類、酯類、胺類、酚類等，但相對含量都較低，在1.0%以下。

3 結論

還原糖、總糖、氨基酸和5-HMF是與類黑精形成直接相關的幾種物質。隨黑蒜加工的深入，各成分含量總糖降低后穩(wěn)定、還原糖升高后穩(wěn)定、氨基酸降低后穩(wěn)定、5-HMF先升后降。類黑精成分分析中，相對含量最高的是呋喃類，其中最高的為烷基呋喃(41.39%)，其次為噻吩、烷烴、吡咯等。產生以上變化趨勢的主要原因是美拉德反應中，糖加熱分解以及糖和氨基酸反應均可生成5-HMF，之后5-HMF進一步轉化生成烷基呋喃；還原糖脫羥基環(huán)化也可生成烷基呋喃。其他吡咯、噻吩等生成也與糖直接相關。這些物質之間的相互轉化，是黑蒜的顏色與口感完全不同于生大蒜的重要原因。