多重熒光PCR方法檢測食品中致病菌的實用研究

◎ 董 睿，孫端方

（1.貴州中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，貴州 貴陽 550009；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，貴州 貴陽 550016）

《國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》和根據(jù)此標準制定的各省市縣級食品監(jiān)抽細則，食品中致病菌是食品檢測的主要對象。致病菌檢測包括沙門氏菌（以下簡稱“沙門”）、金黃色葡萄球菌（以下簡稱“金葡”）、水產(chǎn)品中副溶血性弧菌（以下簡稱“副溶”）、肉制品中單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱“單增”）、牛肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM等。

致病菌檢測的強制國標方法均以篩選培養(yǎng)法為主體，經(jīng)過多重篩選選出疑似陽性樣品后，采用生化方法進行驗證，檢測過程耗時較長、工作量大。多重熒光PCR法在初篩環(huán)節(jié)以其檢測迅速、操作量低等明顯優(yōu)勢，在科研領域已得到反復驗證，但在國內(nèi)監(jiān)抽領域還未采用相關方法。

本研究以沙門、金葡、副溶、單增為檢測對象，驗證多重熒光PCR法在實際食品中致病菌的應用，選用以往省抽備樣中的檢出樣品，設計引物和探針進行檢測；以GB 4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、GB 4789.7-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》、GB 4789.10-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.30-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》為方法對照。

1 材料與方法

1.1 樣品

調(diào)取以往省抽備樣中分別只檢出了沙門、金葡、副溶或單增的食品各10批次，分別設為沙門、金葡、副溶、單增的陽性對照，再互為其他3種菌種的陰性對照，并在檢驗過程中設空白對照。

1.2 方法

1.2.1 熒光PCR法

先按GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016中初次增菌方法進行取樣培養(yǎng)。DNA提取試劑盒為Toyobo MagExtractor?Genome，熒光PCR試劑為Toyobo Thunderbird qPCR Mix，引物探針，見表1。體系配制及反應參數(shù)按試劑說明書。熒光PCR儀為ABI 7500 Fast。

表1 多重熒光PCR引物及探針表

1.2.2 國標方法

按 GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016檢測。

2 結(jié)果與分析

圖1示例了分別只檢出沙門、金葡、副溶或單增的食品各1批次的FAM、HEX、TAMRA、Cy5熒光信號，其中作為陽性對照的熒光呈顯著的S形曲線增長，且Ct值＜30.0，作為陰性對照的熒光無信號增長且Ct值＞40.0，結(jié)果見表2。其余批次也符合實驗要求。該結(jié)果表明多重熒光PCR方法可準確區(qū)分沙門、副溶、金葡、單增，也與國標檢測和生化檢測的結(jié)果相符。

圖1 多重熒光PCR信號曲線圖

表2 多重熒光PCR檢測結(jié)果表

3 討論

食品中致病菌檢測的國標方法通常為3～5 d，基本為純?nèi)斯げ僮鳎M時費力；并且在初篩、復篩的平板菌落挑取過程中，存在肉眼判斷誤差；同時在實際檢測中，成千上萬的樣品數(shù)量使得上述缺點非常顯著。普通PCR法檢測食品中致病菌，檢測時間縮短為2 d左右，操作簡便；在實際檢測中，樣品數(shù)量越多，相對國標方法效率提升越高。

多重PCR在普通PCR基礎上，通過運用多對引物檢測目的基因，成倍提升檢測效率；熒光PCR作為第二代PCR技術，通過監(jiān)測探針或染料在PCR擴增時的熒光信號變化以計算檢測結(jié)果，大幅提高了準確性。多重熒光PCR在熒光PCR基礎上，通過運用多條探針檢測目的基因，結(jié)合上述兩種方法優(yōu)點，同時提升檢測效率和準確性，可逐步運用于日常檢測工作。