高鈣菜莖總黃酮提取及抗氧化活性研究

◎ 李艷紅，彭 偉，侯斯晉

（綿陽市產品質量監督檢驗所，四川 綿陽 621000）

高鈣菜含有豐富的蛋白質、鈣、磷、鐵等礦物質元素，胡蘿卜素、維生素B等營養素[1]，以及生物堿、黃酮類化合物、β-谷甾醇、沒食子酸等功能因子[2-3]，具有較好等抗氧化性、抗炎癥、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等生物活性[4]。目前，國內關于高鈣菜的研究報道主要集中在高鈣菜葉化學成分的分析、高鈣菜總黃酮的提取工藝研究、高鈣菜總黃酮的分離純化以及抗氧化活性研究[5-7]，而且原料大多來自華東、華中、華南（如安徽、湖北）等地。由于高鈣菜除了嫩尖，還有大量的莖，尤其是在大量種植未及時采摘，由于高鈣菜生長旺盛，會有大量莖產生，單純丟棄會造成資源大量浪費。本文主要研究高鈣菜莖總黃酮的提取與抗氧化活性，以期為合理利用該部分資源提供一定的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鈣菜，2017年8月采自西南科技大學蔬菜實驗園，新鮮，無蟲害。

試劑：蘆丁對照品，南京替斯艾么中藥研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、2,2-聯氮-二(3-乙基 -苯并噻唑 -6-磺酸 )二銨鹽（ABTS），SIGMA ALDRICH公司；乙醇、等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

U-3900H型紫外分光光度計，Hitachi日立公司；Agilent1200 系列LC-MS；RE-52A 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；冷凍真空干燥儀，Thermo Electron Corporation。

1.3 試驗方法

1.3.1 高鈣菜莖總黃酮提取工藝

高鈣菜→去葉留莖→清洗→沸水燙漂30 s→55 ℃烘干→粉碎→過60目篩，作為樣品原料→總黃酮提?。弦罕?∶50，提取溫度85 ℃，提取時間4 h，乙醇濃度80%）→離心（4 500 r/min，15 min）→上清液備用。

1.3.2 總黃酮測定與得率計算

1.3.2.1 標準曲線繪制

以蘆丁標準品為對照，采用NaNO2-Al(NO3)3法[8]測定總黃酮含量，以蘆丁含量為橫坐標，吸光值為縱坐繪制標準曲線，以濃度對吸光值進行回歸，計算回歸方程。根據標準曲線計算所得回歸方程為y=1.000 6x+0.006，相關系數R2=0.999 8，x為蘆丁標準液濃度（mg/mL），y為吸光度。

1.3.2.2 樣品總黃酮含量測定

取總黃酮待測液1.0 mL于25 mL具塞試管中，按照標準曲線方法加入待測試劑并測定吸光值，根據標準曲線計算總黃酮得率。

1.3.3 總黃酮抗氧化活性研究

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

以無水乙醇作為參比，參考Helal A等[9]的方法，并略加修改。向比色管中依次加入1 mL不同濃度樣液、2 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫黑處靜置30 min，在517 nm處測定不同時間各濃度樣品溶液的吸光值Ai；分別以等體積去離子水代替DPPH自由基和樣品溶液，分別測定吸光值Aj和Ac。按下式計算DPPH·清除率（K）。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除活性

參照鄰苯三酚自氧化法[9]，并略加修改。在0～180 s內，每30 s在波長319.5 nm處測定一次吸光值。將測量值帶入式（2）計算：

式（2）中：?Ai是加入樣品溶液吸光值隨時間的變化率；?Aj是不加顯色劑溶液體系吸光值隨時間的變化率；?Ac是不加樣液溶液體系的吸光值隨時間的變化率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除活性

參考Helal A等[9]的方法，并略加修改。在25 mL比色管中依次加入40 μL不同濃度試樣及4 mL ABTS陽離子自由基（ABTS+·）測定液，搖勻，準確反應10 min，于734 nm處測定吸光值Ai。以去離子水代替ABTS+·測定液，測定Aj，再以去離子水代替樣液，測定Ac。

1.3.4 數據統計與分析

每組實驗重復3次，結果均以平均值±標準差（X±SD）表示，作圖主要由Excel2013軟件完成。

2 結果與分析

2.1 高鈣菜總黃酮得率

在料液比1∶50，提取溫度85℃，提取時間4 h，乙醇濃度80%條件下，高鈣菜莖總黃酮得率（1.64±0.12）%。

2.2 DPPH自由基清除活性

高鈣菜莖總黃酮、丁基羥基茴香醚（BHA）和VC對DPPH·的清能力結果，如圖1所示。

圖1 總黃酮對DPPH·的清除活性圖

由圖1可知，高鈣菜莖總黃酮和VC對DPPH·的清除率均高于BHA。在實驗范圍內，當抗氧化劑濃度在38.4 μg/mL以下時，莖總黃酮對DPPH·的清除率幾乎呈線性變化，當濃度繼續增加時，DPPH·清除率增幅平緩接近于100%。莖總黃酮、BHA、VC清除DPPH·的 IC50值分別為 15.67 μg/mL、40.80 μg/mL、14.43 μg/mL，3種試樣清除DPPH·能力大小排序為：VC＞莖總黃酮＞BHA。說明高鈣菜莖總黃酮對DPPH·有良好的清除作用，與VC能力相當。

2.3 超氧陰離子自由基清除活性測定

高鈣菜莖總黃酮、BHA和VC對超氧陰離子自由基清能力結果，如圖2所示。

圖2 不同抗氧化劑對超氧陰離子自由基清除活性圖

由圖2可知，隨著試樣濃度的增大，3種抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，但VC對超氧陰離子自由基清除率快速增加至100%，而莖總黃酮和BHA對超氧陰離子自由基清除率增幅較小，在221 μg/mL時，莖總黃酮對超氧陰離子自由基清除率接近于BHA；莖總黃酮、BHA、VC清除超氧陰離子自由基的 IC50值分別為：117.01、144.91、55.65 μg/mL，超氧陰離子自由基清除能力大小依次為VC＞莖總黃酮＞BHA。說明高鈣菜莖總黃酮對超氧陰離子有較好的清除作用。

2.4 ABTS+自由基清除活性測定

高鈣菜莖總黃酮、BHA和VC對ABTS+自由基清能力結果，如圖3所示。

圖3 不同抗氧化劑對ABTS+自由基清除活性圖

由圖3可知，隨著試樣濃度的增大，3種抗氧化劑對ABTS+自由基的清除率呈線性增加，莖總黃酮清除ABTS+自由基能力在各個濃度下均高于VC和BHA，莖總黃酮、BHA、VC清除ABTS+自由基的IC50值分別 為：125.87 μg/mL、175.20 μg/mL、221.29 μg/mL，3種試樣對ABTS+自由基清除能力強弱順序為：莖總黃酮＞BHA＞VC。說明莖總黃酮對ABTS+自由基有良好的清除作用。

3 結語

高鈣菜莖總黃酮得率為（1.64±0.12）%。當高鈣菜莖總黃酮濃度在38.4 μg/mL以上時，高鈣菜莖總黃酮對DPPH自由基清除能力與VC相當，達100%，明顯高于BHA；隨著試樣濃度的增大，VC對超氧陰離子自由基清除率快速增加至100%，而莖總黃酮和BHA對超氧陰離子自由基清除率增幅較小，在濃度為221 μg/mL時，莖總黃酮對超氧陰離子自由基清除率接近BHA，達74.29%；VC、BHA和莖總黃酮隨著試樣濃度的增加對ABTS+自由基的清除率呈線性增加，莖總黃酮清除ABTS+自由基能力在各個濃度下均高于VC和BHA。