虎杖苷對體外培養人翼狀胬肉成纖維細胞增殖的影響

萬金蘭

翼狀胬肉為一種常見的眼科疾病，目前主要治療以手術切除為主或術中聯合應用抗增殖藥治療。有研究表明，角膜表面和結膜下翼狀胬肉組織殘留是手術后復發的主要原因［1］，手術可能為一種刺激因素，當病變組織中的成纖維細胞大量增殖伴發病理表現則在臨床復發。虎杖苷（3，4’，5－三羥基二苯乙烯－3－β－單－D－葡萄糖苷）是從蓼科植物虎杖的干燥根莖中提取的有效成分，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、改善糖脂代謝、臟器保護以及心血管疾病治療作用［2］。該研究以人翼狀胬肉成纖維細胞為材料，通過檢測虎杖苷對人翼狀胬肉成纖維細胞（human pterygium fibroblasts，HPF）增殖的影響，旨在為抗復發治療翼狀胬肉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 虎杖苷（南京青澤醫藥科技開發有限公司，批號：20141106，純度≥98%），RPMI1640 培養液、胎牛血清 （Gibco公司），四甲基偶氮唑藍（MTT），二甲基亞砜（DMSO），PBS 液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，鏈霉素均來自Sigma公司；小鼠抗人角蛋白及波形蛋白單克隆抗體、小鼠抗人PCNA單克隆抗體和羊抗鼠IgG為武漢博士德公司產品。恒溫二氧化碳培養箱，倒置顯微鏡，DG－3022A型酶聯免疫檢測儀，流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方 法

1.2.1 PFB的體外培養、純化及鑒定 選取自筆者所在醫院行翼狀胬肉手術中切除的胬肉組織，將組織塊接種于直徑為6 cm的培養皿中，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM完全培養液，在37℃、體積5%CO2細胞培養箱中培養，換液1次/3～4 d。待瓶底長滿70%～80%細胞后按1∶3傳代。選取第3～4代細胞進行實驗。制作細胞玻片，采用SP法染色鑒定細胞。

1.2.2 MTT檢測虎杖苷對細胞增殖的影響 按1×104/ml將消化好的第3代成纖維細胞轉移到96孔板內，共設4組，每組設復孔4孔，培養24 h，待細胞貼壁后加藥。虎杖苷設陰性對照組、10－2mol/L、10－3mol/L 和 10－4mol/L 組，用來調零的為空白對照組。分別繼續培養24 h，48 h和72 h。吸去上清液，每孔加入 MTT 20μl，孵育 4 h，加 120μl DMSO 后震蕩，各孔490 nm波長處吸光度值（A值）通過酶標儀檢測。

1.2.3 免疫組化檢測虎杖苷對PCNA表達的影響

6 孔板細胞玻片制作好后用 10－2mol/L、10－3mol/L 和10－4mol/L的虎杖苷作用48 h，對照組不加藥。PCNA的表達采用免疫組織化學SABC法染色檢測。隨機計數100個細胞（放大倍率×200），對陽性細胞及陰性細胞總數進行計算。細胞生長抑制率取平均值。實驗組細胞抑制率（%）=（陰性對照組A值－實驗組A值）/陰性對照組A值×100%（A值均取平均值）。

1.2.4 流式細胞儀檢測各細胞周期 將細胞消化、同步化、分組培養同前。先用0.25%胰酶消化和收集細胞，再用體積比為70%乙醇溶液重懸并固定細胞。

2 結果

2.1 翼狀胬肉成纖維細胞免疫組織化學鑒定 組織塊接種培養4～5 d后，細胞呈星芒狀生長，且大部分細胞以梭形為主，同時夾有圓形或多角形細胞；2 W后，呈灶狀或片狀，細胞與細胞間連接成網狀。傳代至3代后，基本為梭形，生長加快。HE染色后見細胞呈現梭形，均胞質，淡紅色，胞質有突起，核藍染，橢圓形，染色質均勻，核仁不明顯（圖1）。細胞培養后經鑒定波形蛋白染色陽性，存在于胞漿，與細胞長軸方向平行，呈棕黃色束狀或網狀結構（圖2）；空白對照未見棕色顆粒（圖 3）。

圖1 人翼狀胬肉組織的培養細胞HE染色呈陽性（×100）

圖2 波形蛋白陽性染色呈均勻一致的棕色顆粒，細胞呈梭形（×100）

圖3 陰性對照無棕色顆粒出現（×100）

2.2 虎杖苷對HPF增殖的影響 不同藥物濃度組對細胞形態作用不同，高濃度組（10－2mol/L）細胞數量減少，呈不規則形且折光性降低，胞質中可見顆粒樣物質；10－3mol/L 濃度組變化不明顯；10－4mol/L濃度組細胞生長旺盛。成纖維細胞給予不同濃度虎杖苷干預24 h，48 h和72 h后，采用t檢驗分別比較各作用時間點及濃度組與對照組細胞A值的差值，不同時間點各濃度組與對照組細胞A值的差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表 1。

表1 虎杖苷不同時點對成纖維細胞增殖的影響（±s）

表1 虎杖苷不同時點對成纖維細胞增殖的影響（±s）

組別 24 h 48 h 72 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對照組 0.514±0.021 0 0.618±0.176 0 0.671±0.198 0 10－2 mol/L 組 0.145±0.047 71.79 0.157±0.046 74.60 0.166±0.051 75.26 10－3 mol/L 組 0.441±0.098 14.2 0.596±0.183 3.56 0.667±0.217 0.6 10－4 mol/L 組 0.579±0.121 －12.65 0.697±0.213 －12.78 0.774±0.245 －15.35

2.3 免疫組化檢測虎杖苷對HPF表達PCNA的影響 細胞核中出現棕黃色、黃色或淺黃色均勻細小顆粒為陽性；細胞核無變化，胞質呈淡黃色為陰性。10－2mol/L 虎杖苷抑制 HPF 表達 PCNA，10－4mol/L虎杖苷促進 HPF表達 PCNA（P＜0.05），詳見表 2。

表2 不同濃度虎杖苷對HPF表達PCNA的影響

2.4 流式細胞儀檢測各細胞周期情況 虎杖苷對細胞周期的影響，10－2mol/L組細胞停滯于G1期；10－3mol/L組G1期細胞數減少，S期細胞數增加；與對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同濃度虎杖苷對成纖維細胞細胞周期的影響（x±s）

3 討論

翼狀胬肉是一種向角膜表面生長與結膜相連的纖維血管樣組織，以鼻側瞼裂區多見。翼狀胬肉含有大量新生的血管纖維組織，具有較強的侵襲性，向角膜緣生長，角膜前彈力層被玻璃樣或彈性組織所代替，角膜正常結構被破壞；向角膜內呈進行性侵入生長，具有腫瘤樣特性，故認為是一種腫瘤樣病變［3］。外界各種刺激作用使結膜下膠原纖維發生變性，同時角膜前彈力層受損致角膜上皮變性，結締組織長入已變性的角膜組織中形成胬肉。本病發病與環境密切相關，如陽光、沙塵等各種慢性刺激，日光中的紫外線是引起翼狀胬肉的重要原因。近期已通過細胞分子生物技術，證明了其發生機制涉及基因成分、抗凋亡機制、細胞因子、生長因子、細胞外基質重塑、免疫和病毒感染等［4］。病理學研究表明成纖維細胞在翼狀胬肉的形成過程中起重要作用，因此，尋找抑制成纖維細胞增殖的藥物非常重要。以往研究表明，在翼狀胬肉發生過程中，細胞凋亡失控而不及增殖，導致結膜纖維組織及新生血管過度增殖。增殖與凋亡的細胞調節基因參與了翼狀胬肉組織的異常增殖。促進凋亡基因表達較抑制凋亡基因表達增強細導致胞凋亡。蘭榕等［5］檢出初發及復發性翼狀胬肉中Bcl－2的表達，翼狀胬肉中Bcl－2的表達較正常球結膜顯著增高，復發性翼狀胬肉中Bcl－2表達高于初發性翼狀胬肉，可見Bcl－2在翼狀胬肉增殖及復發中非常重要。

以往抗纖維化、抗增殖作用的藥物主要為抗腫瘤藥物如5－氟尿嘧啶、絲裂霉素等，這些藥物在抗增殖的同時對正常組織不良反應大，因此臨床應用受限制。近期有研究表明虎杖苷有抗纖維增生的作用，據報道，10－2mol/L虎杖苷對成纖維細胞有促凋亡作用［6］，對正常細胞的毒性較小。 虎杖苷（polydatin，PD）又名白藜蘆醇苷，近年研究［7，8］發現，虎杖苷可有效地抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，對正常細胞毒性較小。虎杖苷可減少心肌缺血/再灌注后線粒體結構的破壞，抑制心肌細胞凋亡，降低凋亡率；增加心肌 B 細胞淋巴瘤－2（B cell lymphoma－2，Bcl－2）蛋白的表達及 Bcl－2/Bax 的比值［9］。

該研究采用了體外細胞培養的方法觀察了不同濃度組虎杖苷對成纖維細胞增殖的作用，10－2mol/L濃度組 HPF表達 PCNA細胞數減少，10－2mol/L濃度組有促進細胞凋亡的作用，10－3mol/L濃度組作用不明顯，相反10－4mol/L濃度組可促進細胞生長，在虎杖苷作用24 h后即可觀察到細胞變化，因此，不同的用途對于濃度的選擇非常重要。另外，10－2mol/L為最合適的濃度，其抗增殖機制有待進一步研究。