不同pH值對肌肉組織中鹽酸克倫特羅ELISA檢測結果的影響

摘要：研究了不同pH值對ELISA法檢測肌肉組織中鹽酸克倫特羅結果的影響。結果表明，在一定pH值范圍內瘦肉精含量與樣品pH值呈極顯著負相關關系；在試劑盒所對應的推薦pH值范圍以內，樣品pH值的變化對檢測結果的影響較小，反之，樣品pH值每調節1個單位所得的檢測結果間差異顯著。

關鍵詞：pH值；肌肉；鹽酸克倫特羅；ELISA

中圖分類號：S859.84 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）02-0023-03

鹽酸克倫特羅屬于β-興奮劑類藥物，俗稱瘦肉精，是一類高度選擇性的興奮劑和激素[1]，可提高動物胴體瘦肉率，近年來被一些人非法添加至飼料中以提高脂肪型動物的瘦肉率和加速動物的生長[2]。人食用了鹽酸克倫特羅殘留的動物性食品，會出現肌肉震顫、心悸、過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發燒、顫栗等癥狀，殘留的鹽酸克倫特羅可引起食物中毒，嚴重者可引起死亡，各國已明文禁止其使用[3]。

本試驗主要研究樣品不同pH值對ELISA檢測結果的影響，為基層檢測鹽酸克倫特羅提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮精瘦牛肉樣品來源于襄陽市云集、帝苑等農貿市場，選取29份樣品進行試驗分析。

1.2 主要試劑與儀器

克倫特羅（CLE）酶聯免疫試劑盒購自北京維德維康生物技術有限公司，乙酸乙酯溶液、異丙醇溶液、高氯酸溶液、NaOH溶液均為市售； SUNRISE酶標儀購自帝肯（上海）貿易有限公司、電子天平購自梅特勒-托利多公司、單道及多道移液器購自芬蘭百得實驗室（儀器）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌肉組織檢測樣品的制備 準確稱取（2±0.01） g均質后的肉脯樣品于50 mL離心管中；加入6 mL 0.2 mol/L高氯酸溶液，渦動至組織完全分散； 室溫[（25±2） ℃]條件下，搖床300 r/min振搖20 min；8 000 r/min離心10 min；將全部上清液轉入新的離心管中，用1 mol/L NaOH溶液調節pH至11.6；加入6 mL乙酸乙酯-異丙醇（3：1）溶液；室溫[（25±2） ℃]條件下，搖床300 r/min振搖20 min；8 000 r/min離心10 min；取2 mL上層有機相于新的離心管中；50～60 ℃水浴中，氮氣吹干；加入2 mL正己烷，高速渦動30 s， 加入1 mL樣品稀釋液，充分渦動1 min；8 000 r/min離心5 min，除去上層正己烷。調節樣品溶液pH，制備不用pH樣品的待檢測樣品。

1.3.2 ELISA檢測不同pH樣品鹽酸克倫特羅 將所需的酶標板條插入酶標板架上，記錄下標準品和樣品的位置，建議均做平行實驗；將20 μL各標準品工作液和不同pH樣品溶液分別加入對應的標準品和樣品孔中；在每個板孔中加入50 μL酶標Ⅱ抗工作液；在每個板孔中加入80 μL的抗體工作液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻，室溫[（25±2） ℃]下，避光反應40 min；揭開蓋板膜；甩掉板孔中液體，在每個板孔加入260 μL洗滌工作液，浸泡30 s；再重復上一步驟3次；甩掉板孔中液體，將酶標板倒置于吸水紙上，拍干；立即在每個板孔中加入100 μL A、B（按體積比1：1）混合液；蓋上蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻，室溫[（25±2） ℃]下，避光反應15～20 min；揭開蓋板膜，在每個板孔中加入50 μL終止液，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻；用酶標儀在450 nm、630 nm下檢測吸光度值，結果在5 min內讀取。

1.3.3 數據統計 利用Excel 2003、RIDAWIN MFC Application和SPSS 17.0軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同pH值對肌肉組織中鹽酸克倫特羅檢測結果的影響

從29份樣品中隨機抽取2份樣品的檢測結果，不同pH條件下檢測鹽酸克倫特羅的結果見表1。

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

從表1可以看出，試劑盒檢測樣品中鹽酸克倫特羅含量受pH值影響的規律比較明顯，隨著pH值由低到高的變化，用ELISA試劑盒檢測到肌肉組織中鹽酸克倫特羅含量逐漸降低。

2.2 同一樣品不同pH值與鹽酸克倫特羅含量之間的相關性

利用SPSS 17.0 軟件對檢測數據進行處理，可得出表2、表3關系矩陣。從表2、表3可以看出，檢測同一樣品不同pH值條件下鹽酸克倫特羅含量時，pH值與鹽酸克倫特羅含量之間呈極顯著負相關關系。

注：“**”表示在0.01的水平差異極顯著（P<0.01），下表同。

3 小結與討論

ELISA檢測技術在實際應用中簡便易學，因而廣泛應用于我們基層實驗室。但其影響因素較多，主要有試劑盒因素和實際操作中的影響因素[4]。

影響試驗結果的試劑盒因素主要有以下5點：①固相載體。可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，是進行酶標記測定的基本條件。②抗原。包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結果均有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優質和穩定的制劑，純度和免疫原性要高，抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。③結合物。用酶標記的抗體或抗原統稱為結合物，酶結合物要求穩定，具有很高的酶活性。④洗滌劑與稀釋劑。為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過量。但在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部分會從固相載體上被洗滌下來，從而很可能會使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質吸附到原來包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產生假陽性反應，這是限制ELISA 特異性的一個因素。⑤底物。各種酶都有對底物的特異性，所以使用不同種類的酶要求有不同的底物[5]。

實際操作中的影響因素主要有以下5 點：①環境溫、濕度。ELISA 檢測中所用試劑與酶的活性有很大關系，試劑盒在用于正式試驗前是否充分回溫、反應過程中溫度變化是否都達到試劑盒要求的反應條件、環境濕度過高或過低對微孔反應板也有較大的影響[6]。②反應時間。ELISA 中所加酶結合物濃度，與加酶結合物后孵育時間以及加底物后孵育時間等3個因素也是相互影響的。酶結合物濃度低，則要求孵育時間延長，而酶結合物濃度高則要求孵育時間縮短，可根據試驗的具體情況，改變不同因素，以取得良好的結果[7]。③洗板。洗板不夠充分或者洗板次數過多、洗板時間過長、甩板過干都會對檢測結果有不同程度的影響。④儀器要求。清潔所用儀器如吸管、燒杯試管，用于酶結合和底物的吸管和容器一定要分開。⑤試驗樣品。血清、血漿或其他體液，均可作ELISA 的試驗樣品（標本）。不同樣本的組成成分、理化性質都有較大區別，樣品性質不同對酶聯免疫反應的影響也各不相同。目前常規試驗分析中所用的試劑盒是既定的，在實際工作中的檢測人員操作嫻熟、技術精湛，環境因素也比較穩定，在嚴格控制實驗條件的情況下應按照試劑要求進行操作。對試驗結果影響最大的是樣品固有的理化性質[8]。

對樣品進行pH值調節后進行分析可知，在試劑盒所推薦的適宜pH值范圍內樣品的檢測結果受pH值影響的差異不顯著，在試劑盒推薦的pH值范圍以外每調高或調低1個pH值單位都會導致檢測結果間產生顯著差異。在實際檢測過程中，若不調節樣品的pH值直接進行檢測可能無法反映樣品中鹽酸克倫特羅的實際含量。建議在用ELISA檢測組織樣品中克倫特羅含量時，一定要按照試劑盒推薦的范圍內調節樣品的pH值，以便得到可靠的檢測結果。

參考文獻：

[1] 劉國艷，柴春彥.如何全面認識“瘦肉精”[J].動物科學與動物醫學，2002，19（6）：1-3.

[2] 張桂才，鹽酸克倫特羅-違禁藥品[J].湖南飼料，2001（3）：11.

[3] 曾 蕓，李 軍. 克倫特羅的殘留與危害[J].廣西畜牧獸醫，

2003（2）：93-95.

[4] 徐國茂，胡翊煒，王 琤，等. 鹽酸克倫特羅檢測中存在的問題[J].廣東飼料，2007，16（3）：37-38.

[5] 范 鋒，毛愛民，倪谷間. 酶聯免疫吸附法測定鹽酸克倫特羅常見誤差分析及解決對策[J].畜牧獸醫雜志，2008，27（1）：28-29.

[6] 賀 艷，鄭文杰，劉 烜，等. 酶聯免疫法測定豬肉中克倫特羅殘留量的測量不確定度評定[J].食品研究與開發，2009，30（4）：123-126.

[7] 王 彪，王登臨，兀 征，等. 豬尿液中鹽酸克倫特羅的檢測及分析[A].獸醫藥品學—2010 第三屆中國獸藥大會論文集[C].北京：中國畜牧獸醫學會，2010.

[8] 李華瑋，李巧枝，衛 麗，等. ELISA 檢測鹽酸克倫特羅殘留時的問題及控制對策[J].河南農業科學，2009（6）：144-146.