液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與代謝組學(xué)

李亞港

摘 要：色譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜分離裝置與各種檢測裝置通過接口技術(shù)連接后而成的一種新型的儀器分析技術(shù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC/MS）由于能夠分離極性的、離子化的、不易揮發(fā)的和熱不穩(wěn)定的化合物，具有更廣闊的應(yīng)用前景。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是代謝組學(xué)的主要分析技術(shù)平臺，隨著LC/MS技術(shù)的不斷發(fā)展，必將會更多地應(yīng)用于代謝組學(xué)方面，為其分析提供更多的方法與方便。本文從當(dāng)前代謝組學(xué)研究平臺技術(shù)的角度，系統(tǒng)地介紹液質(zhì)聯(lián)用方法的基本原理與代謝組學(xué)的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：LC/MS；代謝組學(xué)；藥物分析

一、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理

（1）LC色譜單元部分

①液-固色譜法。液-固色譜法是使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5～10um。適用于分離分子量為200～1000的非離子型化合物，因此這種色譜法常用于分離同分異構(gòu)體。

②液-液色譜法。液-液色譜法是一種基于被測物質(zhì)在固定相和流動相之間的相對溶解度的差異，通過溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配以實現(xiàn)分離的方法。按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。一般的分離方法都是反相色譜法。

③離子交換色譜法。離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面末端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

④離子對色譜法。又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而改善分離效果。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。

⑤排阻色譜法。排阻色譜法的固定相是有一定孔徑的多孔性填料，利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等高分子化合物。

（2）質(zhì)譜單元部分

質(zhì)譜分析的原理是先將待測化合物的分子離子化，然后在電場和磁場共同的作用下，將所得到的不同質(zhì)荷比的分子離子和碎片離子進(jìn)行分離，從而能夠得到一組特征質(zhì)譜圖，由于質(zhì)譜分析特征性強、重現(xiàn)性好，所以作為未知組分分析的一個有效手段和工具，經(jīng)常被用于定性分析。

小型質(zhì)譜儀的質(zhì)譜檢測器（MSD）是最早被用于與GC聯(lián)用的，而MSD與LC的聯(lián)用則是在后才成熟和發(fā)展起來的。

（3）連接部分

由于液相色譜的流動相流速較大，而質(zhì)譜需要在真空的環(huán)境下工作，因此兩者如何連接成為LC/MS技術(shù)的關(guān)鍵。目前的LC/MS接口主要有移動帶（MB）、直接液體引入（DLI）、熱噴霧（TSP）、快原子碰撞（FAB）、顆粒束（PB）、大氣壓（API）接口等。使用最廣的接口設(shè)備是大氣壓接口。

二、常用液相色譜-質(zhì)譜儀介紹

常用的4種LC/MS包括超高壓液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀（UPLC/Q-MS）、液相色譜-四極桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/Q-Trap-MS-MS）、常規(guī)高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀（LC/Q-MS）、超高壓液相色譜-四極桿-時間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC/Q-TOF-MS-MS）。

（1）液相系統(tǒng)（LC系統(tǒng)）。

LC系統(tǒng)包括常規(guī)的LC和UPLC。UPLC在HPLC的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，它涵蓋了小顆粒填料，非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量，靈敏度及色譜峰的容量。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC具有以下優(yōu)點。

①超高分離度。UPLC用1.7μm顆粒提高了分離能力，可以分離出更多的色譜峰，從而對樣品提供的信息達(dá)到了一個新的水平。而且又最大地縮短了開發(fā)方法所需的時間。

②超高速度。UPLC系統(tǒng)在HPLC系統(tǒng)3倍的流速下進(jìn)行而保持柱效不變。其快速分析亦節(jié)省了以往一向耗時的方法驗證的時間，使方法驗證變得簡單快速。

③超高靈敏度。UPLC使用小顆粒技術(shù)可以得到更高的柱效、更窄的色譜峰寬，即更高的靈敏度。同樣，當(dāng)UPLC用于快速分析、用較短色譜柱而使柱效不變時，色譜峰高會相應(yīng)增加。因此，使用UPLC技術(shù)，不僅可以在保持與HPLC相同分離度時提高峰高，而且在改善分離度的同時亦可提高峰高即靈敏度。

（2）質(zhì)譜系統(tǒng)（MS系統(tǒng)）

構(gòu)成MS系統(tǒng)的5個基本部分的組成是相同的，即接口，離子源，真空系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

①電離源。在液質(zhì)聯(lián)用的發(fā)展過程中，出現(xiàn)了各種電離源，主要有電噴霧電離源（ES），大氣壓化學(xué)電離源（APCI）和大氣壓光化學(xué)電離源（APPID）。

②真空系統(tǒng)。真空系統(tǒng)中包括了離子透鏡，質(zhì)量分析器和檢測器3個主要部分。不同的離子源在不同的設(shè)計中一般都是有2～3個不同的真空區(qū)，并由附加的機械泵抽氣形成。

③質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器是LC/MS組合分類中主要的標(biāo)準(zhǔn)之一。質(zhì)量分析器是依據(jù)不同方式將離子源中生成的樣品離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開的儀器，是質(zhì)譜儀的重要組成部件，位于離子源和檢測器之間[1]。常用的質(zhì)量分析器有：單聚焦質(zhì)量分析器、雙聚焦質(zhì)量分析器、四級桿質(zhì)量分析器、飛行時間質(zhì)量分析器、離子冊質(zhì)量分析器，以及離子回旋共振質(zhì)量分析器等，而與LC系統(tǒng)進(jìn)行相連的質(zhì)量分析器主要是：四級桿、離子阱、飛行時間及傅立葉變換。

三、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想[2]，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，尋找代謝物與病理生理變化關(guān)系的研究方式。研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)[3，4]。代謝組學(xué)分析方法要求具有高靈敏度、高通量和無偏向性的特點，因此單一的分離、分析技術(shù)難以滿足這一要求。因此，越來越多的分離、分析手段及其組合出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中[5]。從總體而言，由于LC/MS較高的靈敏度和較寬的動態(tài)范圍，其已被越來越多地應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。

HPLC是代謝組學(xué)研究的重要工具，可靠的HPLC技術(shù)將在代謝組學(xué)研究中發(fā)揮不可替代的作用。目前的研究已證明基于HPLC的代謝組學(xué)有良好的前景。高分辨HPLC/MS-MS系統(tǒng)的廣泛可靠性在獲得代謝指紋譜的分析方法逐漸成為重要的手段[6]。

參考文獻(xiàn)

[1]邱永紅.質(zhì)量分析器新理論初探[J].分析儀器，2014（3）：81-87.

[2]Nicholson J K，Wilson I D.Nat.Rev.Drug Discovery，2003，2（8）：668-676.

[3]賈偉，敖平，王曉艷.科學(xué)，2012，64（6）：12-15.

[4]鄒忠杰，袁經(jīng)權(quán)，龔夢鵑，沈志濱.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2009，25（4）：424-428.

[5]許彬，王海龍，等。代謝組學(xué)分析技術(shù)及其在幾類重大疾病研究中的應(yīng)用[U].分析測試學(xué)報，2006，25（5）：128-132

[6]賈偉.醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2011：193-218.

（作者單位：鄭州大學(xué)）