榴蓮凍肉中污染微生物的分離鑒定和低溫存活時間研究

（綠城農科檢測技術有限公司，浙江杭州310052）

榴蓮富含豐富的蛋白質、維生素及礦物質等，被譽為“水果之王”，但其一旦成熟就不易保存，目前最好的保存方式就是采用深凍技術延長榴蓮保鮮期，也就是榴蓮凍肉，它是水果糕點制品的原材料之一，但仍然逃不過微生物的污染。食品中的生物性污染在國內外都是影響食品安全的最主要原因，食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴發的重要因素，也是食品安全的重要風險隱患[1]。微生物造成的威脅有兩方面：一是微生物毒素或病原微生物對消費者的健康構成威脅，二是食品腐敗造成經濟損失[2]。我國的食品安全國家標準對糕點面包等，均規定微生物限量，控制項目包括菌落總數、大腸菌群、霉菌、及食源性致病菌[3]。食物污染來源的調查研究顯示，不合理的運輸也會導致各類食物甚至非食物類物品間的交叉感染[4]。當榴蓮水果凍肉進行微生物檢測時，菌落總數僅代表衛生指標，但無法明確菌株類別，有必要進行鑒定以明確其污染源。

目前，在食品檢測中細菌鑒定采取傳統手工生化鑒定、半自動或全自動鑒定儀如ATB細菌鑒定儀、VITEK系列鑒定系統等。而在醫療領域，由于大量的臨床標本需要快速鑒定，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix－assisted laser sesorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）應用微生物鑒定以其快速、準確、成本低而占具優勢[5]。食品中出現微生物污染水平較高時，運用該方法進行鑒定較少。試驗采用傳統腸道桿菌及其它革蘭氏陰性菌鑒定試劑條（API 20E）和鏈球菌及有關菌鑒定試劑條（API 20Strep）方法結合 MALDI－TOF－MS 方法，鑒定三類菌落形的細菌，分別為明串珠菌屬，粘質沙雷氏菌和陰溝腸桿菌。了解榴蓮凍肉的污染菌后可以針對它們的來源進行防控措施。粘質沙雷氏菌廣泛分布于土壤及水環境中，其產色素的培養溫度為20℃～36℃，顏色最紅為30℃和28℃，這個結果與已有文獻報導保持一致[6－9]。據報道這是因為粘質沙雷氏菌生長需要礦質元素鉀、鈣而 K+、Ca2+、Cu2+和 Mn2+能顯著提高色素產量[7]；而榴蓮營養成分中富含人體所需的豐富礦物質元素，如鉀、鈣、鐵、鎂、錳、銅等礦質元素[10]。因此，可以通過選擇產色素的溫度作為與其它細菌有效分離的溫度。陰溝腸桿菌是腸桿菌科腸桿菌屬的成員之一，該菌廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、植物中均可檢出陰溝腸桿菌，是腸道正常菌種之一，作為條件致病菌成為人類醫院感染重要的病原菌[11]。陰溝腸桿菌常產生β內酰胺酶，它是導致1代～3代頭孢菌素、單環β－內酰胺類及含酶抑制劑的復合制劑耐藥的重要原因[12]，因此避免因食品污染而感染尤為重要。明串珠菌分布于自然生態環境中綠色植物的地上部分和根，但與需氧細菌和酵母相比數量少（＜1%），來源于自然環境的明串珠菌在蔬菜、飼料和多種發酵食品等各種植物材料中容易繁殖[13]。因此，防范從源頭入手，探索該類水果中微生物檢測鑒定方法的同時，研究污染微生物的低溫存活時間，為人們進行榴蓮水果食品安全生產運輸保藏提供理論信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

榴蓮凍肉：產地泰國，杭州市售。

1.1.2 培養基

平板計數瓊脂（platecountagar，PCA）、氯化鈉胰酪胨大豆肉湯瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA）、營養瓊脂培養基（nutritional agar，NA）：青島高科技園海博生物技術有限公司。

1.1.3 試劑

API 20 E腸桿菌及G－菌、API 20 Strep鏈球菌生化試劑：生物梅里埃中國有限公司；氧化酶試劑、觸酶試劑、革蘭氏染色液試劑等其它生化試劑：青島高科技園海博生物技術有限公司。

1.1.4 儀器

MALDI－TOF MS Clin－ToF－II基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統：北京毅新博創生物科技有限公司；LRH－250F型生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；GI80TW型高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；HFSafe－1500LC II級A2型生物安全柜：上海力申科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數測定

稱取25 g樣品至225 mL 0.85%無菌氯化鈉溶液，取此培養液1 mL加0.85%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿，傾注平板計數瓊脂培養基，于（36±1）℃倒置培養 48 h。

1.2.2 分離純化

選取適宜稀釋度的平板，按不同菌落形態的細菌，分別劃線接種TSA，30℃～35℃培養24 h。產色素的菌株，設置不同溫度進行分離培養，確定產色素溫度范圍和優選最適溫度。分離的菌株通過菌落形態觀察、純化、染色鏡檢后分別保存于25%甘油溶液和瓷珠中，作為供試菌株用于后續試驗。

1.2.3 鑒定方法

傳統方法鑒定：將適宜稀釋度的單個菌落，按不同菌落形態細菌分別分離劃線于氯化鈉胰酪胨大豆肉湯瓊脂培養基（TSA）上，置36℃培養18 h～24 h，挑取單菌落通過革蘭氏染色、鏡檢，革蘭氏陰性桿菌接種到API 20E生化鑒定條，鏈球菌接種API 20 Strep板條，36℃培養24 h，讀生化結果。

MALDI－TOF－MS 用 1 μL 接種環直接挑取單個菌落點涂抹在金屬靶板上，滴加1 μL基質液（50%乙腈與2.5%三氟乙酸混合配制的飽和α－氰基－4－羥基肉桂酸溶液），室溫晾干后將靶板放入MALDI－TOF－MS儀檢測。同時每次試驗用大腸埃希菌DH5α的蛋白抽提液作為校準品和陽性對照。

1.2.4 污染菌的低溫存活時間研究

將第一次檢測完的樣品于－20℃保存，然后每隔2個月按1.2.1進行菌落總數檢測，連續監測12個月，計數并觀察微生物污染情況，同時按最優的鑒定方法進行典型菌落鑒定。將－20℃保存1個月后的榴蓮樣品，測完菌落總數后，放入2℃～8℃冷藏，每天按1.2.1進行菌落總數檢測，連續監測4 d，計數并觀察微生物污染情況，同時按最優的鑒定方法進行典型菌落鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌落總數測定

經檢測榴蓮凍肉樣品中初始污染菌落總數平均為50 000 CFU/g。單菌落出現在1 000倍稀釋梯度，挑選典型菌落共50個用于分離純化鑒定。

2.2 分離純化

挑取梯度中的單菌落，用TSA分離純化得到3種不同菌落形態的細菌。一是紅色大菌落（LHD），菌落占比19%；二是白色大菌落（LBD），菌落大而濕潤的黏液狀，菌落占16%；三是白色小菌落（LBX）菌落，菌落占比65%。因LHD1菌落出現紅色，為了確認紅色產生的溫度范圍，分離時設置了5個溫度分別為15、20、28、30、36、40 ℃見圖 1。

圖1 不同溫度下產紅色素能力Fig.1 The ability to produce red pigment in different temperatures

由圖1可知，紅色素在菌落中分布不均勻，菌落中心先出現，隨著培養時間延長，紅色素分泌至整個菌落。產色素的能力范圍為20℃～36℃，15℃以下，40℃以上菌落生長，但不產色素。顏色最紅的是28℃和30℃，最淺的是20℃。當把20℃的平皿延長培養或移入28℃培養24 h，菌落紅色加深。40℃移入28℃培養24 h出現少部分菌落產紅色素。為了使其與其它細菌明顯有效分開，分離純化時選用產紅色素能力最適溫度30℃。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 傳統鑒定方法結果

經API 20E和API 20 Strep系統生化鑒定，并查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版中描述，表明LHD型菌落共10株，有動力，具有產明膠酶和DNA酶的特性，阿拉伯糖、棉子糖和木糖均為陰性，為典型的粘質沙雷氏菌，檢出率100%，置信度95.9%～99.8%。LBD型菌落共8株，其中1株出現不可接受的生化譜，不能鑒定，其它7株均為陰溝腸桿菌，鑒定置信度為92.9%～97.5%，檢出率為87.5%（7/8）。LBX型菌落菌株共32株，三者中鑒定最困難的菌株，其中出現無可接受生化譜的菌株占9.4%（2/32），檢出置信度低于90%的結果占25%（8/32），置信度為91.2%～98.9%的結果占65.6%（21/32），均為明串珠菌屬某些種。不同菌落形態的細菌鑒定結果具體見表1和表2。50株菌經過傳統鑒定法總的檢出率為76%。

2.3.2 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDITOF－MS）鑒定結果

從分離的單個菌落開始、經涂布、上機檢測讀結果，每個菌在1 min～2 min內完成，操作步驟簡單快速，完成50個單菌落的鑒定，僅耗時1 h。鑒定結果當置信度≥25分，表示結果可信；≤20分鑒定結果不可靠；20分～25分鑒定需通過其他輔助試驗才能選出鑒定結果；試驗表明50株菌包括質控菌株大腸埃希氏菌全部正確檢出，檢出率100%，置信度全部大于25分。相同菌落形態的污染微生物鑒定結果一致，歸類成表4和圖2的結果。

表1 榴蓮凍肉中污染菌形態觀察結果Table 1 The results of colony morphologies for contaminated bacteria in durian frozen flesh

表2 榴蓮凍肉分離菌的生化試驗結果Table 2 The biochemical results of bacteria isolated from durian frozen flesh

表4 榴蓮凍肉中污染菌的MALDI-TOF-MS鑒定結果Table 4 The results of microbe identification in durian frozen flesh with MALDI-TOF-MS

圖2 部分MALDI-TOF-MS鑒定典型圖譜Fig.2 Typical chart of MALDI-TOF-MS identification of colony

2.3.3 榴蓮凍肉中污染微生物存活時間

3組榴蓮凍肉樣品于－20℃保存下，連續監測結果見圖3。

圖3 冷凍（-20℃）保存榴蓮凍肉中污染微生物變化Fig.3 Changes of microbial in durian fresh storage in-20℃

由圖3可知，紅色大菌落（LHD）存活時間為4個月，白色大菌落（LBD）存活時間為8個月，白色小菌落（LBX）存活時間大于12個月。經后續跟蹤鑒定紅色大菌落（LHD）為粘質沙雷氏菌，白色大菌落（LBD）為陰溝腸桿菌和白色小菌落（LBX）為明串珠菌屬。

2.3.4 榴蓮凍肉污染微生物冷藏下微生物的變化

污染微生物的3組榴蓮凍肉樣品于（2℃～8℃）冷藏，微生物變化結果見圖4。

圖4 冷藏（2℃～8℃）保存榴蓮凍肉中污染微生物變化Fig.4 Changes of microbial in durian fresh storage in 2℃-8℃

紅色大菌落（LHD）與白色大菌落（LBD）在數量級上無明顯變化，而白色小菌落（LBX）細菌濃度每天都有增長，第3天達到高峰，出現數量級升至8次方，之后趨向平穩。經后續鑒定該菌為明串珠菌屬。

3 結論與討論

從榴蓮凍肉中分離細菌的報導較少，試驗從榴蓮凍肉污染的50株微生物中分離出3種細菌：10株粘質沙雷氏菌、8株陰溝腸桿菌和32株明串珠菌屬。運用了傳統方法和MALDI－TOF－MS時間飛行質譜進行鑒定。比較得出傳統方法檢出率低僅為76%，且操作繁瑣，即使是用API生化試驗條，分離出單菌落后必須先做革蘭氏染色涂片、氧化酶試驗或觸酶試驗等前期鑒定，才能選擇相應鑒定試條。上試條前還需要制備規定濃度的菌懸液，要求無菌操作技術嚴格，否則影響后續生化結果判讀準確性和工作效率。其次，當某個鑒定結果不能判定時，要求做許多補充試驗。再是人工判讀時對生化反應的結果把握存在因人而異的主觀性，易造成誤判或結果不可讀，試驗中出現4株不可鑒定的菌株，用基質輔助激光解析電離時間飛行質譜，分別檢出為1株陰溝腸桿菌和3株假腸膜明串珠菌。對于菌落形態小的明串珠菌屬，傳統方法鑒定較困難。而MALDI－TOF－MS試驗表明，同時對一個平皿上的多個菌落進行鑒定，效率最高的是MALDI－TOFMS；只要分離到單菌落，檢出率高達100%，不用重復傳統方法的系列生化試驗，上機后僅用3 min～5 min檢出一個結果，完成50株菌僅需1 h，試驗中也得出培養時間24 h和存放更長時間的單菌落，鑒定結果仍一致，不會受到細菌生長時間的影響。食品微生物鑒定中，運用MALDI－TOF－MS自動鑒定儀的方法優于傳統方法，省時省力省成本。

通過分析在榴蓮凍肉中污染微生物的存活周期發現，一旦榴蓮凍肉被上述微生物污染，即使保存在－20℃，微生物仍然會存活較長時間。粘質沙雷氏菌和陰溝腸桿菌在－20℃低溫的榴蓮凍肉內存活時間為4個月和8個月；明串珠菌則時間更長，該榴蓮凍肉在低溫下保藏12個月后，仍檢出高濃度的明串珠菌。在2℃～8℃下放置1 d至3 d，粘質沙雷氏菌和陰溝腸桿菌仍存活，但未見生長繁殖，無明顯變化。而明串珠菌細菌濃度出現數量級上升。在榴蓮隨溫度恢復到室溫，存活能力強的污染菌特別是明串珠菌會迅速生長繁殖起來。可見，低溫保藏時引起榴蓮凍肉微生物持續繁殖的可能主要為明串珠菌。因此，榴蓮水果不宜冷藏，宜冷凍。試驗結果與加拿大水果蔬菜農場食品安全指南一致，在儲藏過程中，應該將水果凍肉速凍以減少病原菌的生長[14]。

綜上所述，榴蓮水果凍肉污染的微生物用MALDI－TOF－MS鑒定，確定為粘質沙雷氏菌、陰溝腸桿菌和明串珠菌屬。粘質沙雷氏菌、陰溝腸桿菌為條件致病菌，明串珠菌對人雖無致病性，但一旦污染會影響水果風味和營養。它們均來自大自然、水果和植物，試驗研究結果給人們對榴蓮水果采摘、生產，保藏提供預防污染的理論依據。另外，分離出的粘質沙雷氏菌是否為產紅色素的高產菌株和基因水平的特點，以及明串珠菌在乳制品食品防腐和醫藥行業具有重要工業價值，但工業用途方面仍然存在菌株差異[15]，其優良特性以及抑菌性[16]有待進一步研究。