RP-HPLC法測定獼猴桃根中兒茶素和表兒茶素含量

王敏，馬玉梅，周曉松

（1.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用醫(yī)藥系，貴州安順561100；2.深圳市泰康制藥有限公司，廣東深圳518110）

獼猴桃根為獼猴桃科植物中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）的干燥根[1]，具有很好的保健用途和藥用價值。可以燒水當(dāng)保健茶喝；是養(yǎng)生膳食原料、保健填充材料、養(yǎng)生藥酒原料以及中藥制藥原料，也經(jīng)常用于養(yǎng)生花草茶、泡腳泡澡等，還可與其它膳食原料做成健康養(yǎng)生膳食，如獼猴桃粥對胃癌病人有特殊補(bǔ)益作用[2-5]。具有清熱解毒，活血散結(jié)，祛風(fēng)利濕的功效，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，淋巴結(jié)結(jié)核，跌打損傷，癰癤[6-11]。中華獼猴桃分布在中國東部地區(qū)，陜西省廣泛栽培，栽植面積超過100萬畝，約占全國60%以上[12]。研究[13]表明，獼猴桃根含熊果酸、齊墩果酸、琥珀酸、胡蘿卜甙以及精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸和黃烷類，香豆素等多種成分元素。目前，有多篇文獻(xiàn)[14-18]研究了獼猴桃根中的黃酮類、齊墩果酸、大黃素等成分的檢測，但是針對獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素的同時檢測未見報(bào)道。本試驗(yàn)建立了同時測定獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素的反相高效液相色譜法，本法操作專一、快速、簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于獼猴桃根的質(zhì)量控制。此外，使用上述方法，本研究還分析了不同采收季節(jié)獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素含量變化。為獼猴桃根的科學(xué)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，為臨床有效、合理、安全使用獼猴桃根提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

以貴州產(chǎn)的初春和秋冬采集的獼猴桃根為材料，粉碎，過三號篩待用。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素（catechin，含量99.2%，批號：110877-201604）、表兒茶素（L-epicatechin，含量 100.0%，批號：110878-200102）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水：純化水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Agilent1260液相色譜儀、AgilentTC-C18（250mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱：美國安捷倫公司；METTLER TOLEDO AG135型電子天平：瑞士梅特勒-托利多。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

精密稱取過三號篩的獼猴桃根粉末5.032 5 g，加水200 mL回流提取5 h，過濾，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次120 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，用50%甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，作為樣品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取兒茶素對照品10.01 mg和表兒茶素對照品10.05 mg至20 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得500 μg/mL的對照品儲備液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。流動相為A：乙腈，B：1%乙酸水溶液，采用梯度洗脫。流動相A 的比例為：0～50 min，5%～15%；50 min～50.01 min，15%～5%；50.01 min～60 min，5%。流動相 B 的比例為：0～50 min，95%～85%；50 min～50.01 min，85%～95%；50.01 min～60 min，95%。流速 1.0 mL/min，柱溫30.0℃，進(jìn)樣體積10 μL。檢測波長為280 nm。

1.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品儲備液取 4、2、0.4、0.08、0.02 mL置10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度。按1.2.3色譜條件，取各濃度對照溶液10 μL進(jìn)入液相色譜儀，以濃度（μg/mL）（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）和線性回歸方程。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批獼猴桃根粉末樣品6份，按1.2.1的方法平行制備6份樣品溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，并計(jì)算兒茶素和表兒茶素含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知兒茶素和表兒茶素含量的獼猴桃根粉末樣品9份，同時分別按高（1∶1.5）中（1∶1）低（1∶0.5）3個質(zhì)量比定量加入兒茶素和表兒茶素對照品，按1.2.1的方法平行制備9份樣品溶液，按1.2.3的色譜條件進(jìn)樣10 μL，根據(jù)測定結(jié)果中兒茶素和表兒茶素的含量計(jì)算相應(yīng)的平均回收率（%）及RSD（%）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 反相高效液相色譜法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）定量分析方法的建立

2.1.1 檢測波長的選擇

兒茶素和表兒茶素在210 nm～350 nm均有吸收峰，但280 nm處的吸收峰最大，因此選擇檢測波長為280 nm。

2.1.2 流動相的選擇

本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[19]，比較研究了甲醇、乙腈與不同濃度的酸（乙酸）作為流動相，對兒茶素和表兒茶素對照品以及獼猴桃根中各組分色譜峰的分離效果，其中以乙腈（A）-1.0%乙酸水溶液（B）分離效果較好。經(jīng)過多次梯度洗脫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洗脫程序?yàn)椋毫鲃酉郃的比例為 0～50 min，5%～15%；50 min～50.01 min，15%～5%；50.01 min～60 min，5%。流動相 B 的比例為：0～50 min，95%～85%；50 min～50.01 min，85%～95%；50.01 min～60 min，95%。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用如上梯度洗脫程序，獼猴桃根中各組分色譜峰峰形尖銳，對稱性好。

2.2 RP-HPLC定量分析的方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

兒茶素線性回歸方程：Y=12.961X-6.642 8相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 9，在 1.0 μg/mL～198.6 μg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。表兒茶素線性回歸方程：Y=12.391X-6.578 5 相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 9，在 1.0 μg/mL～201.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。考察結(jié)果見表1、圖1、圖2。

表1 兒茶素與表兒茶素進(jìn)樣濃度與峰面積Table 1 Injection concentration and peak area of catechin and L-epicatechin

圖1 兒茶素線性關(guān)系圖Fig.1 Linear relationship of catechin

圖2 表兒茶素線性關(guān)系圖Fig.2 Linear relationship of L-epicatechin

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 兒茶素與表兒茶素重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repeatability tests for catechin and L-epicatechin

2.2.3 回收率試驗(yàn)

兒茶素回收率99.16%，RSD0.66%；表兒茶素回收率100.99%，RSD0.74%，均在允許范圍內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3 兒茶素回收率試驗(yàn)Table 3 Recovery tests for catechin

表4 表兒茶素回收率試驗(yàn)Table 4 Recovery tests for L-epicatechin

2.3 不同采收季節(jié)獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素含量

不同采收季節(jié)獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素含量見表5。

表5 不同采收季節(jié)獼猴桃根中兒茶素和表兒茶素含量Table 5 Content of catechin and L-epicatechin in Actinidia chinensis Planch during different harvesting seasons

一般根類植物的采收期是初春和秋冬，由表5可知，初春采收的獼猴桃根中黃烷類成分兒茶素和表兒茶素含量均明顯高于秋冬。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)建立的提取方法可使獼猴桃根中的兒茶素和表兒茶素與其他成分有很好的分離，試驗(yàn)建立的反相高效液相色譜分析方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，兒茶素和表兒茶素線性關(guān)系良好，回收率準(zhǔn)確度較高，RSD低，是一種檢測獼猴桃根中的兒茶素和表兒茶素含量的有效方法。對不同采收季節(jié)的獼猴桃根中的兒茶素和表兒茶素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)春秋采收的獼猴桃根的有效成分明顯高于秋冬。

目前獼猴桃根中兒茶素和表兒茶素同時提取的方法未見報(bào)道，文獻(xiàn)[19]報(bào)道的表兒茶素的提取方法為50%甲醇超聲，雖然能夠提取出表兒茶素但不能提取出兒茶素，并且分離度也到不到要求。本文則采用水提取乙酸乙酯萃取的方法，能夠除去獼猴桃根中許多極性大的成分，使黃烷類成分兒茶素和表兒茶素能夠很好地分離。