響應(yīng)面法優(yōu)化仙人掌果花色苷的提取工藝

吉雪慧，張筠，*，劉術(shù)明，竇迎港

（1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150066；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司，黑龍江安達(dá)151400）

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）為仙人掌屬（Opuntia）植物的果實。果漿肉質(zhì)為紅色或紫色，果肉可食，酸甜可口[1]。由于天然色素對人體無毒無害、營養(yǎng)價值高，而且具有一定的生物活性，因此，研究開發(fā)無毒無害的天然色素就成為了色素未來的發(fā)展趨勢。花色苷是一類廣泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫或者黑的色澤[2]。具有一定的營養(yǎng)和藥理作用，有較高的安全性能，而且具有抗突變、抗氧化、降血壓、保護肝臟等保健功能[3-6]，被廣泛用于功能性食品和保健品的原料和著色，含花色苷的植物提取物已被意大利、德國等國家的藥典收載[7]。目前，仙人掌果除被當(dāng)?shù)乩习傩丈倭坎墒持猓袩o他用。國內(nèi)有關(guān)仙人掌的開發(fā)利用研究的報道較多，但有關(guān)仙人掌果的資料報道甚少。本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，基于響應(yīng)面法（response surface methogology，RSM）研究提取溫度、提取時間和乙醇提積分?jǐn)?shù)對水提取仙人掌果中花色苷進行研究，并確定提取花色苷的條件，為進一步開發(fā)利用仙人掌果中花色苷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南野生仙人掌果；無水乙醇、氯化鉀、濃鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃鹽酸：天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV1800紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機：日本東京理化儀器有限公司；JJ200型電子天平：美國雙杰兄弟有限公司；GL-21M高速冷凍離心機：上海市離心機械研究所；Microstirrer6磁力攪拌器：意大利VELP。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

仙人掌果洗凈、去刺，取適量的仙人掌果原料放入榨汁機中，加水，打成漿，將其漿液倒入培養(yǎng)皿中，放入超低溫冰箱中，使其溫度冷凍至零下，放入真空冷凍干燥機中，待其水分被蒸發(fā)完全，粉碎機粉碎，過100目篩，裝于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2.2 仙人掌果花色苷的提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g原料粉末，加入錐形瓶中并添加一定量體積的乙醇溶液，放置磁力攪拌器中按照預(yù)先設(shè)定的溫度條件預(yù)處理一定的時間，將其倒入離心管中以4 500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心15 min，取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，分別加入10 mL的pH=1和pH=4.5的緩沖溶液，靜置60 min后，用相應(yīng)濃度的乙醇定容。用紫外分光光度計于530 nm處測量其吸光度[8]。用pH示差法計算仙人掌果花色苷的含量，計算公式[9]如下：

1.3 單因素試驗

采用1.2.2設(shè)計的仙人掌果中花色苷的提取方法進行試驗：固定提取時間為60 min，提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%3個因素，考察不同料液比[1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]對仙人掌果吸光度的影響；固定料液比1∶25（g/mL），提取時間為60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%三個因素，考察不同提取溫度（50、55、60、65、70 ℃） 對仙人掌果花色苷吸光度的影響；固定料液比1∶25 g/mL，提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%3個因素，考察不同提取時間（50、60、70、80、90 min）對仙人掌果花色苷吸光度的影響；固定料液比1∶25（g/mL），提取時間為60 min，提取溫度為60℃3個因素，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、45%、50%、55%、60%）對仙人掌果花色苷吸光度的影響。進行單因素試驗，考察各因素變量對仙人掌果花色苷的吸光值的影響。

1.4 仙人掌果花色苷提取工藝優(yōu)化試驗設(shè)計

以料液比為1∶25（g/mL）進行試驗，以530 nm吸光值為指標(biāo)，對提取時間、溫度、提取劑體積分?jǐn)?shù)進行單因素試驗。根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設(shè)計原理[10]，以提取時間、溫度、提取劑體積分?jǐn)?shù)為影響因素，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。試驗因素與水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and levels for optimization

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用spss 20.0進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙人掌果花色苷提取單因素試驗

2.1.1 料液比對仙人掌果花色苷提取工藝的影響

料液比對仙人掌果花色苷提取工藝的影響見圖1。

圖1 料液比對仙人掌果花色苷提取工藝的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由圖1可見，隨著液料比的增大，提取液的吸光值也增加，當(dāng)液料比達(dá)到1∶25（g/mL）時，吸光值最大。此后當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加，吸光值下降，表明花色苷提取率也在下降。這可能是由于色素在高濃度時分子之間存在自聚作用使其比較穩(wěn)定，而增加溶劑時，色素濃度降低以致色素分子之間的作用力變?nèi)酰浞€(wěn)定性下降而容易分解[11]，最后花色苷含量趨于平衡，說明色素已經(jīng)基本提取出來。因此，應(yīng)選擇液料比為1∶25（g/mL），這樣既有利于仙人掌果花色苷的提取，也利于減少后續(xù)濃縮步驟的成本。

2.1.2 提取溫度對仙人掌果花色苷提取工藝的影響

即便如此，我仍固執(zhí)地認(rèn)為，像沙莉這樣的“植物人”只能存活于自然經(jīng)濟社會，在現(xiàn)代商品社會里，終究會被類似于我這樣更富斗爭性的“猛獸”們淘汰出局。我暗下決心，一定要讓她知道我的厲害！

提取溫度對仙人掌果花色苷提取工藝的影響見圖2。

圖2 提取溫度對仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溫度的增加，仙人掌果花色苷的提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到65℃時，提取率達(dá)到最大，隨后再增加提取溫度，提取率反而降低了。這是因為仙人掌果花色苷在低的溫度中不容易浸出，在高溫度下發(fā)生了降解，破壞了結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致吸光度減小。因此，選擇提取溫度為65℃，此試驗結(jié)果與李媛媛[12]研究一致。

2.1.3 提取時間對仙人掌果花色苷提取工藝的影響

提取時間對仙人掌果花色苷提取工藝的影響見圖3。

圖3 提取時間對仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

如圖3所示，隨著提取時間的增加，花色苷的提取率不斷增加。當(dāng)提取時間為70 min時，提取率達(dá)到最高。提取時間較短時，花色苷并未完全浸提，提取時間較長時，空氣的氧化作用使花色苷成分分解進而產(chǎn)生褪色現(xiàn)象[13]。所以導(dǎo)致吸光度不高。因此選擇提取時間為70 min，這與王紅梅[14]在仙人掌果中提取黃酮物質(zhì)工藝優(yōu)化中的最佳提取時間相同。

2.1.4 溶劑體積分?jǐn)?shù)對仙人掌果花色苷提取工藝的影響

溶劑體積分?jǐn)?shù)對仙人掌果花色苷提取工藝的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

通過圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，仙人掌果花色苷的提取率增加，在50%乙醇溶液提取時，提取率達(dá)到最高，隨后逐漸降低，同時也考慮到乙醇濃度越低，溶液沸點越高，不利于后期溶劑的回收處理[15]，故最佳的提取條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2 仙人掌果花色苷提取的最佳工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ偷慕⒓捌浣Y(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（X1）、提取時間（X2）和乙醇濃度（X3）3個影響因素，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗設(shè)計對花色苷提取率（Y）進行優(yōu)化[16]。按照Box-Behnken試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求，對各項回歸系數(shù)進行回歸擬合，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

續(xù)表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計軟件通過逐步回歸對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到花色苷提取率對提取溫度、提取時間、溶劑體積分?jǐn)?shù)3個因素的二次多項回歸模型：Y=289.44+5.84X1-37.91X2+17.50X3-0.65X1X2+2.47X1X3-11.17X2X3-56.95X12-81.34X22-39.02X32。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 二次回歸方程模型方差分析Table 3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度顯著性（P<0.01），失擬項不顯著（P=0.988 5>0.05）[17]，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗誤差較小，故可用此模型對仙人掌果中花色苷提取的工藝結(jié)果進行分析和預(yù)測。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算原理可知，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.982 1，說明模型能解釋98%響應(yīng)值的變化，說明該模型與實際試驗擬合程度良好[18]，用該模型對乙醇提取仙人掌果中花色苷的提取過程進行優(yōu)化是合適的。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)面圖和等高線圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析提取時間、提取溫度以及乙醇的體積分?jǐn)?shù)對花色苷提取率的影響。模型的響應(yīng)面和等高線圖如圖5、圖6和圖7所示。

圖5 時間、溫度對花色苷提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and time amount

依據(jù)各因素X1、X2和X3對響應(yīng)值Y所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，可反映各因素對其響應(yīng)值的影響。等高線的形狀能夠反映這兩種因素交互作用的強弱，結(jié)合對應(yīng)的響應(yīng)面圖能夠分析自變量對響應(yīng)值的影響。當(dāng)?shù)雀呔€越接近圓形，表明這兩種因素對響應(yīng)值的影響不顯著，反之，越接近橢圓，對響應(yīng)值影響越顯著。響應(yīng)面圖可以比較直觀的看出各因素對仙人掌果花色苷提取率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對提取率的影響越大，響應(yīng)值的變化越大[19-20]。由圖5可知，提取溫度和提取時間的曲面的坡度較為平緩，所以這兩個因素對花色苷的提取率的交互作用不明顯；由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的響應(yīng)曲面的坡度較陡，表明仙人掌果花色苷的提取率對乙醇體積和提取溫度的變化較敏感；由圖7可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間響應(yīng)面的坡度較平緩，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對花色苷提取率的響應(yīng)值交互作用不明顯。符合表2中對方程3個交互項的方差分析結(jié)果。因此，各影響因素對仙人掌果中花色苷提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。為進一步確定最佳提取工藝參數(shù)，采用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對模型進行優(yōu)化求解，可得最佳工藝參數(shù)為：提取溫度57.48℃，提取時間70.59 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51.32%，此仙人掌果花色苷的提取率為296.7 mg/100 g。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度對色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and solvent amount

圖7 提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of solvent and time amount

2.2.3 驗證試驗

最優(yōu)工藝條件確定與模型驗證通過Design-Expert.8.0.6軟件對回歸方程進行計算，得提取仙人掌果花色苷最佳工藝條件為：溫度57.48℃，時間70.59 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51.32%。由于對條件可操作性考慮，將最佳提取工藝條件修正為：溫度55℃，時間70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，采用此提取條件進行驗證試驗，重復(fù) 3次，花色苷含量為（284±1.27）mg/100 g，與預(yù)測值296.7 mg/100 g相近。說明通過響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件參數(shù)可靠，具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

在提取溫度、提取時間和溶劑體積分?jǐn)?shù)3個因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法對仙人掌果中花色苷提取的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件為：提取溫度55℃、提取時間70 min、溶劑體積分?jǐn)?shù)51%，此時仙人掌果花色苷的含量為296.7 mg/100 g。此工藝參數(shù)的確定可以減少工藝操作的盲目性，從而對后續(xù)仙人掌果花色苷精細(xì)加工提供理論依據(jù)。