正交試驗優(yōu)化紅參多糖超聲提取工藝

（牡丹江醫(yī)學院，黑龍江牡丹江157011）

紅參（radix ginseng rubra，RGR）為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的栽培品經(jīng)蒸制后干燥根及根莖，性寒，味甘、微苦，具有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血的功效[1]。其生理活性成分主要是人參皂苷、揮發(fā)油和多糖[2-3]。近年來，從各種植物中提取多糖的研究日益增多，植物多糖的生物活性也日漸得到人們的重視。藥理研究表明多糖具有降血糖[4]、降血脂[5]、抗病毒[6]、抗炎[7]、抗氧化[8-9]、免疫調(diào)節(jié)[10]和抗腫瘤[11]等方面的生物活性，且毒副作用小。紅參多糖作為紅參中一種主要的成分，也具備多種生物活性。研究表明，紅參中可溶性多糖含量明顯高于人參、西洋參[12]。故本試驗選取紅參為試驗材料，采用超聲提取法[13]進行多糖提取，采用苯酚-硫酸法[14]進行多糖含量測定，通過單因素試驗、正交試驗，確定紅參多糖的最佳超聲提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅參：吉林省長白縣；葡萄糖（批號110833，分析純）：中國藥品生物制品檢定所，；苯酚（分析純）：沈陽試劑一廠；硫酸（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；無水乙醇（分析純）：哈爾濱市新達化工廠。

HN-1000CT恒溫超聲波提取機：上海汗諾儀器有限公司；SYC-15B超級恒溫水浴：南京桑力電子設備廠；GZX-9070MBE電子恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海予華儀器有限公司；TGL-16C離心機：上海天美科技有限公司；TA 2004電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖使用前，先于105℃烘箱中，烘干至恒重，精密稱取10 mg葡萄糖，用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶，混勻備用。配制成0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于帶塞試管中，用蒸餾水依次補至1.0 mL。加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，震蕩混勻后，與液面垂直逐滴加入5.0 mL濃硫酸，充分混合。置于沸水浴中反應20 min后，取出，室溫下冷卻30 min，以相同處理的蒸餾水為對照組，于490 nm波長處，測定其吸光度A。以標準葡萄糖含量為橫坐標，吸光度A為縱坐標，制定標準曲線。

1.2.2 紅參多糖的含量測定

對紅參多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法。按

1.2.1項下方法操作，根據(jù)標準曲線，計算紅參多糖提取率。

多糖提取率/%=（供試品中糖含量/原料的質(zhì)量）×100

1.2.3 超聲波法輔助提取紅參多糖的工藝流程

紅參粉末+蒸餾水→充分溶解→超聲→真空抽濾→濾液用sevage法除蛋白質(zhì)→濃縮→醇沉→得紅參多糖測吸光度

1.2.4 單因素試驗

試驗采用超聲功率（80、90、100、110、120、140、160、180 W），超聲溫度（30、40、50、55、60、70、80 ℃），料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]及超聲時間（25、30、35、40、45、50、55、60 min）為對紅參多糖提取率的影響進行研究。

1.2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇合適的超聲功率（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、超聲時間（D）為參考因素，以紅參多糖提取率為指標，進行L9（34）正交試驗設計，對紅參多糖的超聲提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and lerels for orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，以吸光度值A為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標（mg），得線性回歸方程：y=7.765x+0.028，R2=0.999 2，試驗表明標準葡萄糖在0.02 mg～0.1 mg之間呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲功率對紅參多糖提取率的影響

稱取5 g紅參粉末，按照超聲功率80、90、100、110、120、140、160、180 W，料液比 1 ∶30（g/mL）、超聲溫度50℃、超聲時間30 min，按1.2.3項下方法提取測定，計算多糖提取率，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，隨著超聲功率的增大，多糖提取率先上升后下降，120 W后增大超聲功率對多糖提取率的影響不大，在超聲功率為100 W處取得最大值，即超聲功率在100 W左右時，紅參多糖的提取效果較好。

2.2.2 超聲溫度對紅參多糖提取率的影響

圖2 超聲功率對紅參多糖提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on extraction rate of red ginseng polysaccharides

稱取5 g紅參粉末，按照超聲溫度30、40、50、55、60、70、80℃，料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 100 W、超聲時間30 min，按1.2.3項下方法提取測定，計算多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲提取溫度對紅參多糖提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of red ginseng polysaccharides

結(jié)果表明，超聲溫度對紅參多糖提取率的影響不大，隨著超聲溫度的增大，多糖提取率逐漸上升，在超聲溫度為60℃時取得最大值，70℃時多糖提取率開始下降，即超聲溫度在60℃左右時，紅參多糖提取效果較好。

2.2.3 料液比對紅參多糖提取率的影響

稱取 5g紅參粉末，按照料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）、超聲溫度 60 ℃，超聲功率100 W、超聲時間30 min，按1.2.3項下方法提取測定，計算多糖提取率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對紅參多糖提取率的影響Fig.4 The effect of the solid-liquid ratio on the extraction rate of red ginseng polysaccharides

結(jié)果表明，隨著料液比的增大，多糖提取率先上升后下降，在料液比為1∶25（g/mL）時取得最大值，紅參多糖提取效果較好。

2.2.4 超聲作用時間對紅參多糖提取率的影響

稱取5 g紅參粉末，按照超聲時間25、30、35、40、45、50、55、60 min，料液比 1 ∶25（g/mL）、超聲溫度 60 ℃，超聲功率100 W，按1.2.3項下方法提取測定，計算多糖提取率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲作用時間對紅參多糖提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of red ginseng polysaccharides

結(jié)果表明，超聲時間對紅參多糖提取率的影響較為明顯，隨著超聲作用時間的增大，多糖提取率逐漸上升，在超聲時間為55 min時取得最大值，即超聲作用時間為55 min左右時，紅參多糖提取效果較好。

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇合適的超聲功率（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、超聲時間（D）為參考因素，以紅參多糖提取率為指標，進行L9（34）正交試驗設計，對紅參多糖的超聲提取工藝進行優(yōu)化見表2，方差分析見表3。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2L9（34）orthogonal experimental results

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experimental variance analysis

由表2正交試驗結(jié)果中R值可知，各因素對紅參多糖提取率的影響程度依次為：超聲時間>超聲功率>超聲溫度>料液比。確定正交試驗優(yōu)化出的最佳提取工藝為A2B1C2D1，即超聲功率100 W，超聲溫度50℃，料液比1∶25（g/mL），超聲時間50 min。由表3方差分析可知，F(xiàn)C＜FB＜FA＜FD＜F0.05，因此超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比對超聲提取紅參多糖的提取率均無顯著影響。

2.3.2 驗證性試驗

按照正交試驗確定的最佳提取工藝條件A2B1C2D1，即超聲功率100 W，超聲溫度50℃，料液比1 ∶25（g/mL），超聲時間 50min 進行提取，平行 3 次，結(jié)果見表4，得出紅參多糖提取率分別為53.77%、53.83%、54.30%，多糖平均提取率為53.98%，RSD值為0.52%（n=3）。計算結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證性試驗Table 4 Verification test

3 結(jié)論

超聲提取法是一種用超聲波強化輔助提取植物多糖的方法。以物理破碎的方式促使植物的有效成分進入到溶劑中。同時，超聲波在液體中形成一種高溫、高壓的環(huán)境，從而達到縮短提取時間的效果。故超聲提取法可用于紅參多糖的提取。

本文通過L9（34）正交優(yōu)化試驗結(jié)果表明，各因素對紅參多糖提取率的影響程度依次為：超聲時間>超聲功率>超聲溫度>料液比。紅參多糖超聲提取的最佳工藝條件為A2B1C2D1，即超聲功率100 W，超聲溫度50℃，料液比 1∶25（g/mL），超聲時間 50min。在最佳超聲提取工藝條件下，紅參多糖平均提取率為53.98%，RSD值為0.52%（n=3），表明此方法提取率高且穩(wěn)定性好。超聲提取紅參多糖工藝簡單、方便、穩(wěn)定、可行，可用于紅參多糖的提取。