薰衣草提取物對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究

王苗苗，韓飛，嚴歡，王紅麗，李慕春

（新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆烏魯木齊830011）

5α-還原酶是一種微粒體酶，依賴還原型輔酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）為供氫體，將睪酮不可逆地轉變為活性更強的、男性生長必需的二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）[1-2]。但高水平的二氫睪酮容易引起雄激素依賴型疾病，如雄激素性脫發、良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌等[3-4]。因此，目前通過抑制5α-還原酶來下調雄激素水平已成為治療雄性脫發、前列腺增生等雄激素依賴型疾病的重要方法。相比其他雄激素拮抗劑，5α-還原酶抑制劑在選擇性阻斷二氫睪酮合成的同時，不影響睪酮的正常水平和生理功能。故以抑制5α-還原酶活性為靶點，篩選各種來源的5α-還原酶抑制劑的相關研究工作亦是目前藥物開發的熱點之一[5]。

5α-還原酶有3種同工酶，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型5α-還原酶受SRD5A1基因編碼，由259個氨基酸組成，最適 pH6～pH8.5；Ⅱ型 5α-還原酶受 SRD5A2 基因編碼，由24個氨基酸組成，最適pH5～pH5.5[6-7]。Ⅰ型5α-還原酶存在于皮膚皮脂腺、汗腺、毛乳頭細胞、成纖維細胞、表皮角質形成細胞、毛囊角質形成細胞等皮膚組織中。而Ⅱ型5α-還原酶主要存在于前列腺、生殖皮膚、附睪、精囊等組織中[6-8]。III型5α-還原酶目前研究較少，在良性前列腺組織中呈低表達，在難治愈的前列腺癌中過度表達，可將睪酮轉化為二氫睪酮，最適pH6.9[9]。目前已有的一些5α-還原酶抑制劑，如非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺，已廣泛用于臨床上。非那雄胺是美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的第一個 5α-還原酶抑制劑藥物，主要選擇性地抑制Ⅱ型5α-還原酶，用于治療前列腺癌、良性前列腺增生和雄激素性脫發。度他雄胺對Ⅰ型和Ⅱ型5α-還原酶無選擇性。依立雄胺選擇性和非競爭性地抑制Ⅱ型5α-還原酶。但這3種藥物都有較強的不良反應，如易致勃起功能障礙、性功能異常、性欲降低、男性乳房女性化等[10-11]。因此，從天然植物中尋找高效、低毒的新型5α-還原酶抑制劑十分必要。

5α-還原酶抑制劑按來源一般分為3類：中草藥來源的成分、微生物來源成分及化學合成的化合物[12]。其中，中草藥5α-還原酶抑制劑作為天然植物來源，無明顯不良反應，且來源廣泛，因此，在治療和預防良性前列腺增生（BPH）和前列腺癌等疾病方面具有良好的應用前景[13]。對5α-還原酶有抑制作用的天然成分主要為黃酮類、丙素類、酮類、萜類、甾體類和鞣質類化合物[14]。本課題組前期研究發現薰衣草正丁醇組分生物活性較其他組分高，故本研究以薰衣草正丁醇組分提取物為研究對象，采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）建立了 5α-還原酶抑制劑體外篩選模型，來考察其對5α-還原酶的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

薰衣草：由伊犁紫蘇麗人有限責任公司提供，經新疆分析測試研究院阿依古麗副研究員鑒定確認；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒、睪酮（分析純）、非那雄胺（分析純）：南京森貝伽生物科技有限公司；還原性輔酶Ⅱ（NADPH）：上海碧云天生物技術有限公司；三羥甲基氨基甲烷[（1，1，1-tris（hydroxymethyl）-methanamin，Tris]：天津市福晨化學試劑廠；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：Fisher公司；其余化學試劑均為國產分析純，實驗用水為去離子水。實驗動物：雄性SD大鼠40只，SPF級，體重180 g～220 g，新疆大學動物實驗中心提供（合格證號SCXK（新）2016-0020）。

1.1.2 儀器設備

紫外分光光度計（UV-2700）、制備液相色譜儀（LC-20AP）：日本島津公司；碎樣機（RT-02A）：北京開創同和科技發展有限公司；電子天平（TE612-L）：賽多利斯科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS）：上海博迅實業有限公司；冷卻水循環機（H50）：萊博科泰公司；超高效液相色譜儀（ACQUITYUPLC）：美國Waters公司；實驗室冷凍干燥機（ALPHA2-4/Ldplus）：德國CHRIST 公司；分析天平（ME204）：梅特勒-托利多；聯用型平行蒸發儀（Multivapor P12）：瑞士步琦公司；超純水系統（MINI-QACHANLAGE A10）：美國密理特公司；石英比色皿：大連市日普利科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薰衣草提取物制備

取薰衣草干花適量，用碎樣機粉碎，過篩，保存備用。稱取粉碎后的樣品于錐形瓶，加入70%的乙醇（料液比 1 ∶10，g/mL），80 ℃回流提取 1 h，過濾，重復提取2次，合并2次濾液，減壓濃縮至無醇味，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得5個組分，減壓濃縮后凍干，稱重，保存；將這5個組分分別進行總黃酮含量的測定，選出最優組分為薰衣草正丁醇組分，以正丁醇組分進行試驗，其余組分保存以備后用；取適量薰衣草正丁醇組分提取物加甲醇超聲溶解，定容，進制備液相（YMC C18柱，流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，50 min）按時間收集，得50個組分，濃縮，凍干稱重；取適量甲醇溶解，定容，放于4℃冰箱保存，作為進行5α-還原酶抑制活性測定的樣品溶液。

1.2.2 Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的制備及定量

1.2.2.1 制備

制備方法參考文獻[15]，取雄性SD大鼠40只，禁食不禁水過夜后處死，迅速取肝臟及附睪（剝離脂肪組織），稱重，生理鹽水漂洗，剪碎，加入5倍量預冷的勻漿液[1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris－HCl緩沖液，pH 值分別為 7.5，5.5[肝臟中富含Ⅰ型酶，三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=7.5；附睪中富含Ⅱ型酶液，三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=5.5]在玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4℃及3 000 g離心10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g離心60 min，取上清液即為粗酶，分裝，保存于－80℃超低溫冰箱中，臨用前取出。

1.2.2.2 定量

采用Lowry法蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白含量，以粗酶中的總蛋白含量表示5α-還原酶的濃度，操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 薰衣草提取物對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性研究

方法參考文獻，反應體系含有50μL提取液、300μL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液[Ⅰ型酶液用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液pH=7.5，Ⅱ型酶液用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液 pH=5.5]、50 μL 1 mmol/L的睪酮、50 μL 2.5 g/L 的非那雄胺、500 μL 酶溶液，加入1 mmol/L NADPH 100 μL后反應開始[15-16]。混合溶液37℃溫育60 min，加入1 mL預冷甲醇終止反應，混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液并用0.22 μm濾膜過濾，供檢測睪酮剩余濃度，反應體系見表1。

表1 5α-還原酶的抑制活性研究反應體系Table 1 Reaction system for inhibition activity of 5α-reductase μL

續表1 5α-還原酶的抑制活性研究反應體系Continue table 1 Reaction system for inhibition activity of 5αreductase μL

用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系統分析檢測睪酮的含量，儀器條件如下：YMC-Triart C18（100 mm×2.0 mm，1.9 μm）；柱溫為 30℃；流動相：乙腈-水（70/30，體積比）；流速0.2 mL/min；檢測器為紫外檢測器，242 nm。配制不同濃度的的睪酮溶液進行液相色譜分析，作標準曲線。

2 結果與分析

2.1 Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶粗酶濃度結果

以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標得出BSA標準曲線見圖1。

圖1 BSA標準曲線Fig.1 The standard curve of the BSA

由圖1可知，BSA標準曲線為Y=0.7875X+0.0657，R2=0.999。經計算肝臟中粗酶濃度為22.42 g/L（Ⅰ型酶），附睪中粗酶濃度為1.78 g/L（Ⅱ型酶）。

2.2 薰衣草提取物對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制結果

配制 0.29、0.58、1.44、2.88、5.77、14.42、28.84 mg/L的睪酮溶液進行液相色譜分析，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，制作睪酮標準曲線。睪酮的標準曲線為 Y=9 175 441.97X+4 165.42，R2=0.999，表明睪酮在0.29 mg/L～28.84 mg/L與峰面積具有良好的線性關系，可以用于含量測定。睪酮標準溶液的液相色譜圖見圖2。

通過色譜測定反應液中睪酮的含量，抑制活性的強弱用抑制率表征，如下式所示：

圖2 睪酮標準圖譜Fig.2 UPLC chromatogram of testosterone standard

抑制率/%=（空白管睪酮濃度的變化值－樣品管睪酮濃度的變化值）/空白管睪酮濃度的變化值×100

樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性見表2、圖 3、圖 4。

表2 樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性數據表Table 2 The inhibitory activities towards the two 5α-reductase isozymes

續表2 樣品對Ⅰ型及Ⅱ型5α-還原酶的抑制活性數據表Continue table 2 The inhibitory activities towards the two 5αreductase isozymes

圖3 提取物對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅠ

圖4 提取物對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory activities of plant extracts in vitro against 5α-reductaseⅡ

由圖3、圖4及表2可知，大部分薰衣草正丁醇提取物對Ⅰ型5α-還原酶（肝臟）表現出了抑制作用，其中20、43、44、50號提物作用較為顯著；除薰衣草正丁醇提取物21、35、44號樣品外，其余樣品均對Ⅱ型5α-還原酶（附睪）表現出了抑制作用，其中43號提取物作用較為顯著；同時也可看出薰衣草正丁醇提取物對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用明顯高于對Ⅱ型5α-還原酶的抑制作用。

綜上所述，薰衣草正丁醇提取物有39個樣品對Ⅰ型5α-還原酶有抑制作用，有48個樣品對Ⅱ型5α-還原酶有抑制作用，雖然對Ⅱ型5α-還原酶抑制作用較廣泛，但對Ⅰ型5α-還原酶的抑制作用強（抑制率>50%）的樣品個數更多。

3 結論與討論

目前報道的5α-還原酶抑制劑體外篩選方法有放射性同位素法、紫外分光光度計法、氣相色譜-質譜法和高效液相法等，各方法中酶的制備方法、檢測原理和數據分析手段相似。各篩選方法的具體特點表現為：放射性同位素法靈敏度高，效率高，但因涉及放射性危險，需要檢測同位素的專有儀器，方法開展場地受限；紫外分光光度計法利用分光光度計來檢測結果，儀器易獲取、操作簡單快捷、經濟實用，避免了放射性危險因素，缺點是由于NADPH是許多酶的輔酶，所以在5α-還原酶純度不高的情況下，實驗結果易受到其他酶影響導致準確度下降；氣相色譜-質譜法檢測準確度較好，干擾較少，但需要大型的專有儀器，方法開展也受限；高效液相法5α-還原酶抑制劑體外篩選模型在借鑒分光光度計法和同位素法的基礎上，通過液相色譜儀進樣，使5α-還原酶抑制劑體外篩選過程程序化，準確度高，重復性好，干擾少，同時，克服了同位素法存在放射性危險這一弊端，縮短了藥物篩選周期，提高工作效率。

在本研究中，采用（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法建立了穩定的5α-還原酶抑制劑的體外篩選模型，研究發現，薰衣草正丁醇部分20、43、44、50號樣品均為潛在5α-還原酶抑制劑（對Ⅰ型5α-還原酶的抑制率分別為54.02%、58.79%、57.74%、53.73%，對Ⅱ型5α-還原酶的抑制率分別為30.88%、59.94%、-0.06%、26.12%），這可能導致發展新的天然藥物治療雄激素相關疾病，但提取物中的物質尚未完全清楚，有必要進行進一步的標準化植物成分的識別，此外，其可能的作用機制尚未明朗，還需要通過進一步的研究探索。