紅景天苷提取工藝優(yōu)化及對(duì)FADS1基因表達(dá)的影響

羅毅皓，萬玉慧，孫萬成

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

隨著國(guó)民生活水平的日益提高，人們的飲食結(jié)構(gòu) 發(fā)生了巨大改變，高脂類食物的攝入比例逐步增加，隨之而來的人體脂肪代謝問題引起了廣泛的關(guān)注。各種降脂類食品的研發(fā)及需求日益增長(zhǎng)，更多能改善人體脂肪代謝速率的新產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。紅景天一直被認(rèn)為是抗缺氧、抗疲勞以及抗衰老等作用的佳品[1]，王樹海通過研究紅景天苷對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝的作用機(jī)理及影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以增加脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取和利用[2]，王崢嶸通過研究紅景天提取物對(duì)高脂飲食大鼠肝臟PPAR－α、PPAR－γ的影響，對(duì)小鼠的血生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，研究表明紅景天提取物有效地降低了小鼠血液中的甘油三酯、高膽固醇、高游離脂肪酸含量，證明紅景天提取物可有效改善脂肪代謝[3]。然而鮮有關(guān)于紅景天苷在細(xì)胞層面對(duì)脂肪代謝影響的研究，本試驗(yàn)則設(shè)計(jì)通過使用組織細(xì)胞培養(yǎng)，定量加入紅景天苷的方式，從分子水平探討紅景天苷作用細(xì)胞脂肪代謝后的結(jié)果，即通過測(cè)定與細(xì)胞脂肪代謝有關(guān)酶的基因（fatty acid desaturase 1，F(xiàn)ADS1）表達(dá)量來進(jìn)一步探討紅景天苷對(duì)細(xì)胞脂肪代謝的影響。

本試驗(yàn)通過研究紅景天苷的提取溫度、時(shí)間、料液比等幾個(gè)因素對(duì)提取率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅景天苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出水提法提取紅景天苷最佳提取工藝條件，最終建立一個(gè)高效、節(jié)能、無毒、無污染、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的紅景天苷的提取方法[4]。隨后進(jìn)行HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞密鋪于培養(yǎng)瓶底80%～90%左右時(shí)，通過添加不同濃度的紅景天苷至組織細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行提取總RNA的提取，隨即在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)組織細(xì)胞中FADS1基因mRNA的表達(dá)水平，分析FADS1基因在不同濃度紅景天苷培養(yǎng)下的相對(duì)表達(dá)量差異，探究紅景天苷對(duì)細(xì)胞脂肪代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

紅景天樣品：青海可可西里食品有限公司，用KC－130小型粉碎機(jī)將其粉碎后，貯存于4℃冰箱內(nèi)備用；紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；HepG2肝癌細(xì)胞：上海生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒（提取 RNA）、TaKaRa PrimeScriptRRT reagent Kit試劑盒（反轉(zhuǎn)錄）、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ：寶生物工程（大連）有限公司；DEME（高糖）培養(yǎng)基、雙抗、DPBS、胎牛血清FBS、胰蛋白酶細(xì)胞消化液：生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR儀（ABI 97000）：上海迭戈生物科技有限公司；熒光定量 PCR（CFX96 TouchTM）：BIO－RAD 公司；Leica熒光倒置顯微鏡（DMI4000B）：北京萬泰恒通國(guó)際科貿(mào)有限公司；CO2培養(yǎng)箱（IL161CT）：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅景天苷提取與檢測(cè)

將干燥的紅景天根樣品置于粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取1.000 0 g紅景天粉末置于錐形瓶中，以蒸餾水為溶媒，在時(shí)間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、溫度 40、50、60、70、80℃等試驗(yàn)條件下進(jìn)行提取操作，隨后進(jìn)行真空抽濾，收集濾液。將濾液在沸水中加熱2 min～3 min，隨后置于冰箱冷卻，經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾，濾液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容[4]。吸取1 mL提取液于100 mL容量瓶中再次定容，并于紫外分光光度計(jì)下波長(zhǎng)為275 nm進(jìn)行吸光值A(chǔ)的檢測(cè)（m2=0.087 2A+0.129 2），紅景天苷的濃度在 20 μg/mL～120 μg/mL 與吸光度呈線性相關(guān)，按公式計(jì)算紅景天苷得率：

式中：E為紅景天苷得率，%；m為稱取樣品的質(zhì)量，mg；m2為提取液中紅景天苷的濃度，mg/mL。

1.3.2 HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.3.3 HepG2肝癌細(xì)胞總RNA的提取、PCR及熒光定量PCR

HepG2肝癌細(xì)胞總RNA的提取、PCR及熒光定量PCR方法參考文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化紅景天提取工藝

在已知單因素的試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)定A（提取溫度）、B（提取時(shí)間）、C（料液比），以 Z1=（A－50）/10，Z2=（B－1.5）/0.5，Z3=（C－20）/10 為自變量，紅景天苷得率為響應(yīng)值（Y），利用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及其水平如表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Table of factors and levels for design

響應(yīng)面分析試驗(yàn)共有17個(gè)試驗(yàn)，中心試驗(yàn)用來估計(jì)誤差。17組響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析Table 2 Analysis of response surface

響應(yīng)面分析如圖1～3所示，圖1是提取溫度（A）和提取時(shí)間（B）對(duì)提取率影響，圖2是提取溫度（A）和料液比（C）對(duì)提取率影響，圖3是提取時(shí)間（B）和料液比（C）對(duì)提取率影響。

圖1 提取溫度（A）和提取時(shí)間（B）對(duì)提取率影響Fig.1 Temperature（A）and extraction time（B）influence on extraction rate

圖2 提取溫度（A）和料液比（C）對(duì)提取率影響Fig.2 Effect of temperature（A）and material liquid ratio（C）on extraction rate

圖3 提取時(shí)間（B）和料液比（C）對(duì)提取率影響Fig.3 Effect of time（B）and liquid ratio（C）on extraction rate

在一個(gè)因素已經(jīng)確定的情況下，另外兩個(gè)因素的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出先增大后減小的變化，從響應(yīng)面最高點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的等值線內(nèi)可以看出，在所選區(qū)域范圍內(nèi)存在著極值，既是響應(yīng)面上的最高點(diǎn)，也是等值線內(nèi)最小橢圓內(nèi)的點(diǎn)。圖1可以看出隨著A、B數(shù)值的減小，響應(yīng)值Y大幅度減小，說明短時(shí)、低溫不利于紅景天苷的提取，圖3直觀表明料液比的加大及提取時(shí)間的加長(zhǎng)，紅景天苷部分水解，會(huì)導(dǎo)致小幅度區(qū)間內(nèi)紅景天苷的得率的降低[6-8]。

響應(yīng)面方差分析見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析表Table 3 Response surface variance analysis

由此可知，一次項(xiàng)B是高度顯著的，二次項(xiàng)A2、B2、C2也是高度顯著的，所選因素對(duì)響應(yīng)值的關(guān)系非簡(jiǎn)單線性關(guān)系。經(jīng)二次回歸擬合，得到回歸方程：Y=1.82+0.056×A+0.22×B+0.099×C+0.015×A×B-2.500×10-3×A×C+5.000×10-3×B×C-0.49×A2-0.26×B2-0.23×C2

從上表數(shù)據(jù)中可以得出，各因素對(duì)紅景天苷提取率的影響次序依次為：B>C>A，即提取時(shí)間>料液比>提取溫度。可信度分析見表4。

表4 可信度分析表Table Reliability analysis

由表4可知，該回歸模型也是高度顯著的。判定系數(shù)R2=0.982 6，可以表明紅景天苷提取率有98.26%來源于所選變量，使用上述回歸方程來模擬，三因素三水平的試驗(yàn)是切實(shí)可行的。由Design-expert8.0.6處理以上數(shù)據(jù)，得到最佳提取溫度為50.64℃、提取時(shí)間 1.71 h、料液比 1 ∶22.22（g/mL），理論最佳提取率為1.89%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，試驗(yàn)條件修正為紅景天苷提取溫度為50.6℃、提取時(shí)間1.7 h、料液比 1∶22.2（g/mL），進(jìn)行紅景天苷提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到的平均提取率為1.85%，與理論值相差0.04%。因此，響應(yīng)面法對(duì)紅景天苷提取條件的優(yōu)化是可行的。

2.2 紅景苷對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞FADS1基因表達(dá)影響

2.2.1 HepG2肝癌細(xì)胞FADS1基因擴(kuò)增電泳

圖4為肝癌細(xì)胞提取的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增后得到FADS1的DNA電泳跑膠圖。利用在編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)的FADS1基因通用引物擴(kuò)增目的DNA，獲得約120 bp的DNA片段。

圖4 FADS1基因電泳圖Fig.4 FADS1 gene electrophoresis diagram

從圖4中可以看出反轉(zhuǎn)錄得到的確為實(shí)驗(yàn)所需的FADS1目的基因，無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，且樣品擴(kuò)增條件的退火溫度48.9℃適宜，可將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)[9-12]。

2.2.2 紅景苷對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞中FADS1基因表達(dá)影響

紅景苷對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞中FADS1基因表達(dá)影響如圖5所示，隨著紅景天苷濃度增加，F(xiàn)ADS1基因表達(dá)量增加。

脂肪酸去飽和酶1（FADS1）基因作為人體內(nèi)n-3及n-6系列脂肪酸轉(zhuǎn)化的限速酶基因，其表達(dá)量決定細(xì)胞合成不飽和脂肪酸能力的高低。如圖5可知，紅景天苷可以有效提高FADS1基因表達(dá)量，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多脂肪酸去飽和酶，從而調(diào)節(jié)與載體結(jié)合的飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸在酰基鏈上形成更多雙鍵，最終使脂肪酸不飽和程度提高，而起到降低血脂的作用[13-17]。

圖5 不同紅景天苷濃度組FADS1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of FADS1 gene in the different concentration of rhododendrons

3 結(jié)論

1）紅景天苷響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，提取最佳工藝為提取溫度 50.6℃、時(shí)間 1.7 h、液料比 1∶22.2（g/mL）。

2）各因素對(duì)紅景天苷提取率的影響次序依次為：提取時(shí)間>料液比>提取溫度。

3）紅景天苷提取過程中為防止紅景天苷水解，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間、高料液比處理。

4）紅景天苷可刺激與脂肪代謝有關(guān)的FADS1基因表達(dá)量的增加，促進(jìn)脂肪酸去飽和酶的合成，影響人體脂肪代謝過程，使機(jī)體內(nèi)飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸含量降低，多不飽和脂肪酸含量增加。