痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)診斷肺結(jié)核的臨床意義

馮彥軍，李小紅，凌 寅，王霞芳，葉志堅(jiān)，吳妹英

肺結(jié)核是發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結(jié)核病變[1]。2016年WHO的結(jié)核病報(bào)告顯示：全世界2015年新發(fā)結(jié)核病患者超過1000萬，而中國(guó)大陸新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)（93萬）居全球第3位，僅次于印度和印度尼西亞[2]。肺結(jié)核患者的早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療可以有效防止肺結(jié)核傳播，但由于肺結(jié)核臨床表現(xiàn)及胸部影像學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜多變、涂片陽性率低、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等原因，尋找快速、有效的肺結(jié)核確診方法仍是目前一個(gè)重要的問題。結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)（晶芯分枝桿菌核酸檢測(cè)），采用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌的核酸，能在3 h內(nèi)完成檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)快速診斷。本文回顧分析了136例肺結(jié)核患者痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)該項(xiàng)檢驗(yàn)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值進(jìn)行總結(jié)，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2016年5月—12月在蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院結(jié)核病科住院患者，經(jīng)改良羅氏結(jié)核培養(yǎng)法確診為肺結(jié)核的患者136例（痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為確診標(biāo)準(zhǔn)）。其中男86例，女50例，年齡為14～70歲，平均為37歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集方法 將所有受檢對(duì)象清晨漱口后咳出的深部痰液分別裝入一次性痰瓶中，加蓋送檢，痰液標(biāo)本應(yīng)避免唾液混入。

1.2.2 所有受檢對(duì)象均行痰涂片找抗酸桿菌，并進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。具體檢測(cè)方法如下。

1.2.2.1 抗酸染色檢測(cè) ①取標(biāo)本（痰液濃厚部分）進(jìn)行涂片；②在火焰上加熱固定；③加石碳酸復(fù)紅溶液，再次加熱至蒸汽出現(xiàn)，約5 min后用水洗，加入脫色劑，輕搖玻片至無紅色脫落，再次水洗，加入復(fù)染液，再次染色約1 min；④晾干玻片，最后放置在顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2.2 結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè) ①將10%NaOH和痰液等體積混合，在振蕩器上振蕩混勻約2 min，常溫下靜置30 min；②12 000 rpm離心2 min，棄上清；③加入1 ml洗液，振蕩混勻，12 000 rpm離心2 min，棄上清；④用移液器將剩余液體吸干，注意不要碰到沉淀；⑤加入50 μl核酸提取液，混勻，轉(zhuǎn)移到核酸提取管；⑥置于核酸提取儀中，以最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min，置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min；⑦瞬時(shí)離心，上清用于核酸檢測(cè)。通過2個(gè)通道的擴(kuò)增情況對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀（表1）。

表1 分枝桿菌DNA檢測(cè)結(jié)果判定Table 1 Determination of Mycobacterium DNA test results

1.2.2.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn) ①將收集的患者痰標(biāo)本按常規(guī)方法處理后置于BACTEC MGIT-960結(jié)核桿菌培養(yǎng)儀中培養(yǎng)。②將培養(yǎng)獲得的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥物敏感（藥敏）試驗(yàn)（比例法）：將待測(cè)菌液制成10-2g/L和10-4g/L的細(xì)菌液，用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)（22SWG）分別蘸取1環(huán)（即0.01 ml）的細(xì)菌液，用劃線法均勻接種至培養(yǎng)基表面（對(duì)照及含藥分別接種），最終的接種量為10-4mg和10-6mg。③接種后將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中，4周后讀取菌落數(shù)并計(jì)算耐藥百分比，＞1%為耐藥，≤1%為敏感。

1.3 儀器與試劑 生物顯微鏡CX41（三目）購(gòu)自日本奧林巴斯公司。分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購(gòu)自博奧生物有限公司，國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401215號(hào)。BACTEC MGIT-960結(jié)核培養(yǎng)儀購(gòu)自BD生物科學(xué)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用CHISS 2004統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)和痰涂片找抗酸桿菌2種方法進(jìn)行相關(guān)性分析和檢出率差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種檢驗(yàn)方法的靈敏度 136例痰結(jié)核培養(yǎng)確診的肺結(jié)核患者中，痰涂片找抗酸桿菌的靈敏度為47.06%（64/136），痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)的靈敏度為64.71%（88/136），高于痰涂片找抗酸桿菌。

2.2 2種檢驗(yàn)方法的相關(guān)性和差異性 136例肺結(jié)核患者中，痰涂片找抗酸桿菌陽性64例，痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性88例。痰涂片找抗酸桿菌陰性的72例患者中痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性29例，占40.28%。2種檢驗(yàn)方法相關(guān)性檢驗(yàn)用四格表χ2檢驗(yàn)，χ2=39.978，P=0.000，說明2種方法具有相關(guān)性。2種檢驗(yàn)方法檢出率差異性檢驗(yàn)用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)校正公式，校正χ2=15.559，P=0.000，結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性率（64.71%，88/136）大于痰涂片找抗酸桿菌法（47.06%，64/136）。見表2。

表2 痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)與痰涂片找抗酸桿菌結(jié)果比較（例）Table 2 Comparison of detection results of sputum Mycobacterium tuberculosis DNA test and sputum smear looking for Acidfast bacillus (cases)

3 討 論

肺結(jié)核是一種具有漫長(zhǎng)歷史的慢性傳染性疾病，目前有死灰復(fù)燃的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康，全球有22個(gè)肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家，我國(guó)是其中一個(gè)，同時(shí)我國(guó)也是全世界27個(gè)耐多藥結(jié)核流行的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[3]。控制和管理肺結(jié)核的最大障礙是缺乏快速、準(zhǔn)確和具有成本效益的檢測(cè)方法[4]。肺結(jié)核以病原學(xué)檢查為確診的主要依據(jù)，目前肺結(jié)核的診斷依賴于傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)[5]，但這2種方法都不能滿足臨床需求。痰涂片找抗酸桿菌雖然簡(jiǎn)便、快速、易行，但敏感性差，陽性率低，只有13.85%～22.90%[6-7]，且容易出現(xiàn)假陰性，通常每毫升痰液有5000～10 000條桿菌時(shí)才能檢出。且涂片陽性只表明有抗酸桿菌，是否為結(jié)核分枝桿菌還須進(jìn)一步確認(rèn)。分枝桿菌的培養(yǎng)是結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)。傳統(tǒng)的固態(tài)培養(yǎng)法，需要4～6周才能檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)，而且陽性率只有30%～40%，特異度差，各種分枝桿菌均可生長(zhǎng)，要確定是否為結(jié)核分枝桿菌，須結(jié)合分枝桿菌菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)[9]。液體培養(yǎng)目前主要有羅氏改良培養(yǎng)法，培養(yǎng)周期約5周，顯然滿足不了臨床快速診斷的需求。因此，探索早期、快速、準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核的方法成為當(dāng)前結(jié)核病研究的重點(diǎn)[10]。

而隨著分子生物學(xué)迅速發(fā)展，利用核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌逐步應(yīng)用于肺結(jié)核的診斷。核酸檢測(cè)是對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的DNA或RNA核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽性提示標(biāo)本有結(jié)核分枝桿菌存在，在排除標(biāo)本核酸污染的前提下可確認(rèn)存在結(jié)核分枝桿菌。目前核酸檢測(cè)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的靶序列較常用的有插入序列6110、MBP64基因、rpoB、熱激蛋白65等，主要采用的檢測(cè)技術(shù)包括傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、半巢氏全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因探針檢測(cè)和交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。其中最具代表性的是Xpert技術(shù)，該技術(shù)可在2 h內(nèi)檢測(cè)痰液標(biāo)本是否存在結(jié)核分枝桿菌，并能檢測(cè)利福平的耐藥性，已被WHO推薦為疑似結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的初篩方法[11]，但該法檢測(cè)步驟較為繁瑣，儀器與試劑價(jià)格昂貴，在一般實(shí)驗(yàn)室難以開展。

結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)，采用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌核酸，能在3 h內(nèi)完成檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)快速診斷，是目前國(guó)內(nèi)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)證的可以快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸的PCR產(chǎn)品。本研究回顧性分析136例痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)確診肺結(jié)核患者的臨床資料，痰涂片找抗酸桿菌陽性64例（47.06%），痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性88例（64.71%）。痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性率明顯高于痰涂片，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在痰涂片找抗酸桿菌陰性的72例患者中痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性29例，占痰涂片陰性肺結(jié)核患者比例的40.28%。說明痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)能提高涂陰肺結(jié)核的診斷水平，對(duì)涂陰肺結(jié)核的診斷具有重要意義。本研究中發(fā)現(xiàn)有5例肺結(jié)核患者，痰涂片找抗酸桿菌陽性，但結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陰性，考慮可能與痰液標(biāo)本采集不嚴(yán)格、試劑、實(shí)驗(yàn)操作因素等有關(guān)，提示要嚴(yán)格把控痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)過程，以提高痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性。為了說明痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核診斷的意義，本研究?jī)H選擇了診斷明確的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的患者作為觀察對(duì)象，沒有納入陰性的疑似患者，無法計(jì)算該診斷方法的特異度，但目前已有臨床報(bào)道該方法特異度為98.9%（271/274）[12]，特異度比較高。

在臨床工作中，遇到痰涂片找抗酸桿菌檢查結(jié)果未出或陰性，但結(jié)核中毒癥狀明顯，反復(fù)高熱，結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)陽性的患者，結(jié)合患者胸部影像學(xué)改變及其他輔助檢查提前診斷性抗結(jié)核治療，患者發(fā)熱癥狀得到良好的控制，因此早期的結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)對(duì)臨床診治有重要參考意義。

4 結(jié) 論

痰結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)是一種快速、敏感的病原學(xué)診斷方法，優(yōu)于常規(guī)的痰涂片找抗酸桿菌方法，能夠輔助涂陽肺結(jié)核的診斷，并提高涂陰肺結(jié)核的診斷水平，為涂陰肺結(jié)核的臨床診斷提供重要依據(jù)，對(duì)肺結(jié)核的防治具有重要意義，臨床應(yīng)用有良好前景。