Fyn與小鼠肝纖維化模型中膽汁酸代謝組分的相關性研究

杜桂芳，董金珂，張 婷，楊新瑞，盧姍姍，曲建慧，陸蔭英，洪智賢

肝纖維化是肝臟彌漫性細胞外基質過度沉積，匯管區纖維結締組織增生的病理改變[1]。目前已知在慢性炎癥誘導的肝臟持續損傷修復過程中，肝臟代謝網絡會發生顯著變化，進而影響到機體內眾多的內源性小分子代謝物及其上下游生物學通路功能，而紊亂的代謝通路反過來又會加重炎癥相關肝纖維化的進程和轉歸，形成惡性循環[2-3]。膽汁酸（bile acids, BAs）是膽汁中一類膽烷酸的總稱，可直接反應肝臟的代謝功能狀態[4]。在肝臟病理狀態下，BAs代謝障礙，表現為患者血清中BAs水平增高、組成比例失衡；而異常的BAs代謝產物可通過影響免疫細胞、肝細胞的功能及腸道菌群等來反饋調節BAs的腸肝循環及肝病進程[5]。Src激酶的活化可以影響分子滲透相關信號通路，進而影響滲透依賴的BAs的合成[6]，也有助于BAs穿過膽小管膜和BAs的轉運[7]。Fyn為Src激酶家族的重要成員之一，可以介導高滲透壓誘導的膜轉運蛋白Mrp2 和Bsep的回運，進而促進BAs的回流和膽汁淤積[8]。本研究檢測了四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠血清中BAs各組分含量的變化，并在此基礎上，初步探索其相關的分子機制。

1 對象與方法

1.1 CCl4誘導小鼠肝纖維化模型的建立 實驗動物為6周齡的C57BL/6小鼠，SPF級，雄性，18～20 g[購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物合格SCXK（蘇）2011-0003，NO.201607595]。將實驗動物分為健康組和肝纖維化組，每組5只小鼠。正常喂養健康組小鼠，不進行操作；對肝纖維化組小鼠從第1周開始腹腔注射10%CCl4（橄欖油配制），注射體積2 ml/kg，每周3次，共6周，形成肝纖維化進行后續的檢測。

1.2 血清和肝臟標本的制備

1.2.1 血清制備 6周后，對小鼠進行摘眼球取血，血液室溫靜置30 min，3000 rpm，離心20 min，吸取上清，-80 ℃凍存。

1.2.2 肝臟處理 取出小鼠肝臟拍照、稱重，然后剪取左肝葉放入凍存管中，立即置于液氮中，然后放置于-80℃冰箱用于提取蛋白、RNA及細胞因子測定。剩余肝臟在磷酸鹽緩沖液中清洗2次后，放入50 ml 離心管中用多聚甲醛溶液浸泡固定，用于石蠟切片。

1.3 小鼠肝纖維化程度的評估

1.3.1 血清ALT和透明質酸的檢測 將小鼠血清用0.9%NaCl溶液稀釋5倍，送至解放軍第三〇二醫院檢驗科檢測ALT和透明質酸。

1.3.2 病理檢測 用HE染色、Masson染色和Cordon-Sweet 網狀纖維染色檢測肝臟組織的損傷和纖維化程度。

1.4 BAs檢測 用液相色譜-質譜聯用儀（liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS）檢測血清中BAs各組分的含量

1.4.1 色譜條件 柱溫為40 ℃；流速為0.4 ml/min；流動相為A：水+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸胺；B：80%甲醇+20%乙腈+0.1%甲酸。

1.4.2 質譜條件 噴霧電壓2.0 kV；毛細管溫度275 ℃；S-lens 55%；碰撞能量 27% HCD；分辨率設置一級70 000@m/z 200，二級17 500@m/z 200；母離子掃描范圍m/z 300～1800；子離子掃描范圍start from m/z 100。

1.4.3 標準品儲備液配制 適量粉末溶于水-乙腈-異丙醇溶液 （水∶乙腈∶異丙醇=10∶6∶5），配制成濃度為10 mg/ml溶液；氯磺丙胺標準品儲備液：適量粉末溶于甲醇，配制成濃度為10 mg/ml甲醇溶液。

1.4.4 血清樣品處理 -80 ℃低溫保存的干燥后樣品，4 ℃解凍。定量稱取約50 μl于離心管中，加入 0.5 μg/ml內標溶液 10 μl，冷蛋白沉淀液300 μl，渦旋 45 s，4 ℃下，以 16 000 g/min，離心10 min，取上清液200 μl，吹干。用甲醇50 μl復溶，進樣 5 μl。

1.4.5 數據處理 參照BAs標準品數據庫，用PeakView1.2軟件將樣品中的BAs定性，用MultiQuant2.1 對定性的BAs定量，用樣品中的內標校正后，用標準曲線計算相應濃度。

1.5 儀器和試劑

1.5.1 儀器 LC/MS所用儀器為Eksigent LC100和AB SCIEX Triple TOF 5600+（Waters，美國）；色譜柱為 Waters XBridge Peptide BEH C18 3.5 μm，2.1 mm×100.0 mm（Waters，美國）；預柱為Phenomenex C18，4 mm×20 mm（Waters，美國）。

1.5.2 試劑 CCl4、橄欖油、蘇木精、伊紅等均購自國藥集團化學試劑有限公司，0.9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業股份有限公司；BAs標準品均購自Sigma公司；Western Blot所用anti-Fyn抗體（貨號：sc-434）購自santa-cruz公司，antiα-SMA抗體（貨號：ab5694）購自abcam公司，anti-GAPDH抗體（TA-08）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.6 統計學處理 用SPSS 17.0 處理數據。計量資料呈正態分布，以±s表示，2組間比較用成組t檢驗（組間方差齊）。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠纖維化程度的病理評估 肝纖維化形成的判斷依據為肝臟表面不光滑，HE染色顯示肝臟組織中多數中央靜脈區和匯管區出現炎癥、多個點/灶壞死、存在肝細胞水樣變性（圖1箭頭所示），網狀纖維染色顯示肝臟出現大量纖維組織增生（圖1箭頭所示）。肝纖維化小鼠經過6周的CCl4誘導，每只個體均達到肝纖維化標準，相對于健康組，誘導后小鼠血清中透明質 酸 [（435.0±62.9）μg/L vs. （1124.0±328.6）μg/L，t=0.405，P=0.002]和 ALT[（41.0±15.2）U/L vs.（227.0±41.0）U/L，t=9.512，P=0.000]的 含 量顯著升高。以上結果說明小鼠肝纖維化模型誘導成功。

2.2 BAs代謝譜分析 取血清樣本，運用LCMS/MS代謝組學研究技術平臺檢測BAs代謝情況，結果顯示：肝纖維化造模后，小鼠血清中BAs各組分普遍升高。相對于健康組，肝纖維化組中鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid, CDCA）[（0.063±0.017）ng/ml vs.（0.145±0.013）ng/ml，t=8.568，P=0.000]、去氧膽酸（deoxycholic acid,DCA）[（0.312±0.014）ng/ml vs.（0.987±0.241）ng/ml，t=6.252，P=0.000]、 牛 磺 -β-鼠 膽 酸（tauro-βmuricholic, T-βMCA）[（0.501±0.114）ng/ml vs.（1.735±0.476）ng/ml，t=5.637，P=0.000]、熊 去 氧 膽 酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）[（0.042±0.013）ng/ml vs. （0.187±0.035）ng/ml，t=9.512，P=0.000]、α-鼠 膽 酸（α-muricholic acid, α-MCA）[（0.131±0.050）ng/ml vs.（1.004±0.345）ng/ml，t=5.600，P=0.001]、β-鼠 膽 酸（β-muricholic acid, β-MCA）[（0.324±0.104）ng/ml vs.（1.598±0.302）ng/ml，t=8.919，P=0.000]顯著升高，差異有統計學意義（圖2）。

圖1 小鼠肝纖維化病理圖片Figure 1 Pathological picture of liver fibrosis of mice

圖2 2組BAs代謝譜組分比較Ctrl.健康組；CCl4.肝纖維化組；橫標目均為組別；*. P＜0.05Figure 2 Comparison of bile acids metabolic components between 2 groups

2.3 小鼠肝臟組織中Fyn表達量與肝纖維化的關系 提取小鼠肝臟組織全蛋白組，運用Western Blot檢測Fyn的表達情況，結果顯示：相對于健康對照組，肝纖維化造模后小鼠肝臟組織中 α-SMA[（1.000±0.155）vs.（4.496±1.052），t=7.352，P=0.000）]與 Fyn[（1.000±0.270 ）vs.（1.954±0.534），t=3.565，P=0.007）]的 表達量顯著升高，差異有統計學意義（圖3）。

圖3 小鼠肝臟組織中Fyn表達量與肝纖維化的關系GAPDH. 內參蛋白Figure 3 Correlation between Fyn expression level and liver fibrosis of mice

圖4 Fyn表達量與血清中BAs代謝組分的相關性分析Fyn表達量為灰度值，無單位Figure 4 Correlation analysis between Fyn expression and metabolic components of BAs in serum

2.4 Fyn表達量與血清中BAs代謝組分的相關性分析 小鼠肝臟中Fyn的表達量與血清中UDCA （r=0.761，P=0.011）、DCA（r=0.789，P=0.007）、牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid, TCDCA）（r=0.799，P=0.006）的濃度呈正相關，差異具有統計學意義（圖4）。

3 討 論

在BAs合成的經典途徑中，肝細胞內膽固醇在限速酶膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的作用下生成7α-固醇繼而轉化成初級BAs：膽酸及CDCA，它們與牛磺酸或甘氨酸結合后隨膽汁進入膽管，流入腸道，在腸道內受細菌作用轉化成相應的次級BAs：UDCA、石膽酸（lithocholic acid,LCA）/鼠膽酸（小鼠特有）及DCA等；替代途徑則是在限速酶氧化甾醇27α羥化酶（CYP21A1）的作用下生成次級BAs。約95%的次級BAs被腸道重吸收，經門靜脈重新回到肝臟，與新合成的結合BAs一起再經過膽道排入腸道，稱為“BAs的肝-腸循環”。 在生理狀態下，上述過程受到一系列正、負反饋機制和多種信號通路的精細調節[9]。既往研究表明，在HCV導致的肝纖維化患者中，纖維化程度與血清中BAs水平呈正相關關系[10]。在HBV導致的肝硬化患者中，血清5種BAs： 甘氨膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺膽酸、TCDCA及甘氨熊去氧膽酸的動態水平與肝纖維化的不同階段（Child-Pugh分期A～C期）顯著相關，血清BAs的動態變化是表明肝功能惡化程度、肝硬化分期、監測肝硬化進展的潛在重要標志物[11]。在膽汁淤積型患者中，血清中LCA和DCA的減少、血清硫化BAs增加與膽汁淤積程度相關[12]。

我們的研究發現，利用CCl4誘導C57BL/6小鼠形成肝纖維化后，運用LC-MS/MS代謝組學研究技術平臺檢測BAs代謝情況，血清中BAs各組分普遍升高，其中肝纖維化組中CDCA、DCA、T-βMCA、UDCA、α-MCA、β-MCA 相對健康組有顯著升高。其中CDCA能被用來治療BAs缺乏的患者，UDCA是一種高度可溶的和無毒的BAs，已被FDA批準用于膽石溶解和治療原發性膽汁性肝硬化，而DCA具有高毒性，并且會促進結腸癌的發生[9]。文獻報道，Src 激酶家族在BAs轉運和合成過程中起重要的作用：Src激酶的活化可以影響分子滲透相關信號通路，進而影響滲透依賴的BAs的合成[6]，也有助于BAs穿過膽小管膜和BAs的轉運[7]。Fyn為Src激酶家族的重要成員之一，Fyn可以介導高滲透壓誘導的膜轉運蛋白Mrp2 和Bsep的回運，進而促進BAs的回流和膽汁淤積[8]。我們的研究發現，Fyn在肝纖維化組小鼠肝臟中的表達量顯著高于健康組，并且Fyn的表達量也顯著升高并且與血清中UDCA、DCA、TCDCA的含量呈正相關的關系。根據以上結果，我們推測Fyn在BAs合成和轉運過程中可能扮演重要的角色，進而影響肝纖維化的形成，但其具體機制還有待探索。因此，以Fyn及BAs轉運調控途徑為靶點進行抗肝纖維化藥物的開發具有潛在的臨床應用價值。

我們的研究明確了CCl4誘導小鼠肝纖維化模型中BAs代謝譜的改變，并初步探索了BAs合成與轉運的分子機制。全面深入地了解肝纖維過程中BAs代謝組分的變化規律及調控機制，不但有助于闡明其在肝臟慢性炎癥及纖維化過程中的生物學作用，還有望找到影響肝纖維化進程的關鍵靶點，開發抗肝纖維化藥物[13]。然而，關于肝纖維化形成分子機制和BAs代謝組學的研究還存在很多未知，我們在今后的研究中將繼續探索，為肝纖維化的診療尋找更多的理論依據。