高血壓超重人群腸道菌群的研究

金 翎，崔 曉，蔡 軍

血壓升高是一個復雜的過程，受遺傳學、人口學、共病、環(huán)境等多方面因素及相互之間作用的影響。最近的研究顯示，腸道微生物菌群的紊亂與高血壓的發(fā)病之間也有著非常強的關聯(lián)性。如：16S rDNA測序發(fā)現(xiàn)高血壓動物和高血壓患者腸道微生物的豐度及多樣性有所降低[1]；宏基因組測序發(fā)現(xiàn)鹽敏感高血壓大鼠和鹽非敏感高血壓大鼠的腸道菌群不同，且鹽敏感高血壓大鼠菌群紊亂與血壓升高有關[2]。本課題組前期利用宏基因組和代謝組學對41名健康對照者，56例高血壓前期患者及99例原發(fā)性高血壓患者進行綜合分析，在發(fā)現(xiàn)高血壓前期患者和高血壓患者腸道微生物變化的基礎上，通過將高血壓患者的糞菌移植至無菌小鼠體內(nèi)的方式，明確了菌群紊亂與血壓升高的因果關系[3]。

肥胖不僅與多種心血管事件（cardiovascular diseases, CVD）發(fā)病率的增加有關，如高血壓、代謝綜合征，同時，它也是心血管疾病發(fā)生的危險標志物和獨立危險因素[4]。有證據(jù)表明，在超重和肥胖的成年人中CVD的發(fā)生風險增加，體質量減輕和血壓的降低之間存在著直接的關系。據(jù)報道，高血壓病人體質量減輕5%，可使得其收縮壓降低3 mmHg，舒張壓降低2 mmHg；且超重和肥胖的2型糖尿病患者經(jīng)過4年5%體質量減輕后，與沒有體質量減輕的對照組相比，服用的降壓藥量明顯減少[5]。本研究擬探索高血壓超重/肥胖人群的腸道菌群變化，以進一步揭示此類人群的發(fā)病機理，為高血壓治療提供理論依據(jù)。

1 對象及方法

1.1 對象 本研究共入組68例健康人和73例高血壓患者，將高血壓患者根據(jù)身高體質量指數(shù)（body mass index, BMI）進一步分為高血壓體質量正常組和高血壓超重/肥胖組。所有個體均來自45～60歲的“開灤研究”人群。排除標準：吸煙，進行降壓治療，有腫瘤、心力衰竭、腎功能衰竭、中風等疾病，或3個月內(nèi)服用抗生素或益生菌。每位參與者均簽署知情同意書。整個研究通過開灤總醫(yī)院和阜外醫(yī)院倫理委員會的倫理審核。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床檢查和問卷調查 包括：吸煙、飲酒、生活方式、家庭病史、身體活動、已知疾病的診斷及治療（高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥、中風等）以及身高、體質量、腰圍、臀圍等測量，并計算BMI。BMI是衡量人體胖瘦程度和是否健康的常用指標。成年人的BMI處于18.5～25.0 kg/m2被認為是正常體質量；處于25.0～29.9 kg/m2被認為超重；超過30.0 kg/m2則被視為肥胖[6]。空腹血樣生化檢查項目包括血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、TG、TC、CRP等。

參與者在測量血壓前3 h禁止吸煙或喝咖啡、茶、酒精等，也禁止在測量血壓前30 min進行任何運動。血壓采用坐姿測量，用水銀血壓計對左上臂每隔5 min記錄1次讀數(shù)，共計3次，取其平均值作為最終的血壓數(shù)據(jù)，若3個測量中的2個數(shù)值相差超過5 mmHg，則進行額外的測量。符合赫爾辛基宣言。根據(jù)國際高血壓指南的標準JNC7，血壓正常者的收縮壓＜120 mmHg且舒張壓＜80 mmHg，高血壓者的收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg。

1.2.2 樣品采集和DNA提取 無菌標本盒收集每個參與者的新鮮糞便樣本≥2 g，立即于-80 ℃冷凍，然后用冰袋運送到實驗室。用CTAB 裂解液和溶菌酶于65 ℃水浴中裂解糞便樣品，離心取上清，用酚、氯仿、異戊醇和異丙醇抽提菌液DNA，并用75%乙醇洗滌沉淀。最終的DNA樣品用雙蒸水溶解。

1.2.3 宏基因組測序及Metagenome組裝 檢測合格的DNA樣品用covaris超聲破碎儀（covaris，美國）隨機打斷成長度約為350 bp的片段，經(jīng)末端修復、加尾、加接頭、純化、PCR擴增等步驟完成對整個文庫的構建。文庫構建完成后，使用agilent 2100對文庫中各插入片段大小進行檢測，符合預期后，使用q-PCR的方法對文庫有效濃度準確定量。當庫檢合格，文庫的有效濃度＞3 nmol/L，在Illumina PE150平臺進行測序。

因測序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的低質量數(shù)據(jù)，我們通過Readfq（V8）對原始數(shù)據(jù)進行質控及宿主過濾，去除質量閾值≤38的低質量堿基超過40 bp的片段、去除N堿基長度值≥10 bp的片段、去除與接頭部分重疊超過15 bp的片段，以得到有效高質量的片段進行后續(xù)分析，確保信息分析結果的準確可靠。接著，將質控后的有效數(shù)據(jù)進行Metagenome組裝，包括SOAPdenovo（V2.04）軟件對有效數(shù)據(jù)的組裝分析和SOAPdenovo（V2.04）/MEGAHIT（v1.0.4-beta）軟件對各樣品未被利用的片段混合組裝。

1.2.4 基因預測及豐度分析 采用MetaGeneMark對各樣品及混合組裝長度≥500 bp的片段進行開放閱讀框預測，用CD-HIT軟件對預測結果去冗余。使用 Bowtie2軟件將各樣品的有效數(shù)據(jù)比對至初始基因目錄，計算得到基因在各樣品中比對上的片段數(shù)目。只有匹配片段≥2的基因才被列入考慮與樣本相關。從比對上的片段數(shù)目及基因長度出發(fā)，計算得到各基因在各樣品中的豐度信息。

1.2.5 物種注釋和功能數(shù)據(jù)庫注釋 物種注釋使用 DIAMOND軟件，將各基因與NCBI的NR數(shù)據(jù)庫中抽提出的細菌、真菌、古菌和病毒序列進行比對。對于每一條序列的比對結果，選取evalue≤最小evalue×10的結果，并采取最近公共祖先（lowest common ancestors, LCA）算法來確定該序列的物種注釋信息。

常用功能數(shù)據(jù)注釋采用DIAMOND軟件，將各基因與eggNOG功能數(shù)據(jù)庫進行比對。對于每一條序列的比對結果，選取最佳匹配結果進行后續(xù)功能分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布，用±s表示，2組間比較用成組t檢驗（組間方差齊）。2組間計數(shù)資料比較用四格表χ2檢驗或校正χ2檢驗或確切概率檢驗。使用Metastats分析組間物種差異和功能差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 高血壓人群腸道菌群的種類和功能變化 本項目共入組68例健康人（血壓正常組）和73例高血壓患者（高血壓組）。每組入選人的人口學及臨床資料特征見表1。可以看到，除血壓外其余指標2組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

使用 DIAMOND軟件，將各基因與NR數(shù)據(jù)庫中抽提出的細菌、真菌、古菌和病毒序列進行比對，并采取 LCA 算法來確定該序列的物種注釋信息。根據(jù)菌群在屬層級的相對豐度，我們選取組間Z分數(shù)有顯著差別的細菌，繪制豐度信息熱圖，并使用Metastats分析組間物種差異。如圖1所示，血壓正常組和高血壓組存在差異的菌群種類。如：高血壓組的陰溝腸桿菌屬細菌的豐度相對于血壓正常組顯著降低（P=0.018）；副桿菌屬細菌的豐度則在高血壓組中略有增多（P=0.042）。

為了進一步描述高血壓對腸道微生物群功能的影響，我們根據(jù)樣品在eggNOG數(shù)據(jù)庫中的功能注釋及豐度信息，選取豐度差異排名前 35 的功能并聚類。如圖2所示，與血壓正常組相比，高血壓組菌群中整合酶家族、TonB依賴性受體、多肽酶、乙酰轉移酶、組胺酸激酶等功能增強。

表1 參與者的人口學及臨床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of all participants

2.2 超重/肥胖對高血壓人群腸道菌群的種類和功能影響 肥胖作為心血管疾病發(fā)生的危險標志物和獨立危險因素，與高血壓發(fā)病率的增加有關。因此，我們依據(jù)BMI值，將高血壓人群分為體質量正常組（BMI＜25.0 kg/m2）和超重 / 肥胖組（BMI≥25.0 kg/m2），以研究超重/肥胖對高血壓人群腸道菌群的影響。2亞組的人口學及臨床資料特征見表2，可以看到除BMI和高密度脂蛋白外其余指標2組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖2 2組腸道菌群中功能相對豐度的聚類分析H.高血壓組；C.血壓正常組Figure 2 Cluster analysis of functional relative abundance of gut microbiota in 2 groups

表2 高血壓組的人口學及臨床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of hypertension group participants

通過DIAMOND軟件，我們將各基因與NR數(shù)據(jù)庫中抽提出的細菌、真菌、古菌和病毒序列進行比對，并采取 LCA 算法來確定該序列的物種注釋信息。接著，根據(jù)菌群在屬層級的相對豐度，我們選取組間Z分數(shù)有顯著差別的細菌，繪制豐度信息熱圖，并使用Metastats分析組間物種差異。如圖3所示，高血壓體質量正常組和高血壓超重/肥胖組存在差異的菌群，如：克雷伯菌屬細菌、固氮螺菌屬細菌、阿克曼屬細菌和小桿菌屬細菌在高血壓超重/肥胖組的豐度相對于高血壓體質量正常組顯著升高，P值分別為0.015、0.046、0.022和0.004；高血壓超重/肥胖組中副桿菌屬細菌的豐度比高血壓體質量正常組顯著降低（P=0.046）。

我們從eggNOG數(shù)據(jù)庫中選取菌群功能豐度差異排名前 35 的功能，并進行聚類。如圖4A所示，與高血壓體質量正常組相比，高血壓超重/肥胖組腸道菌群中與轉座酶、DNA結合蛋白、細胞膜、TonB依賴性受體、多肽酶等功能增強有關。利用 Metastats 方法對組間的菌群功能豐度數(shù)據(jù)進行假設檢驗。從不同層級的功能相對豐度表出發(fā)，將得到的P值進行校正，得到q值。我們發(fā)現(xiàn)，與序列特異性的DNA結合功能（ENOG4111N2I）、轉錄調節(jié)功能（ENOG4111Q2I）相關的菌群豐度在高血壓超重/肥胖組中比高血壓體質量正常組顯著增加（q＜0.05）。

3 討 論

本課題組前期利用宏基因組和代謝組學對41名健康對照者，56例高血壓前期患者及99例原發(fā)性高血壓患者進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)克雷伯腸道微生物在高血壓前期患者中顯著增多[3]。本研究對高血壓人群隊列進一步分析，發(fā)現(xiàn)此類菌在超重/肥胖組中豐度顯著高于體質量正常組。

目前已有證據(jù)表明，除高脂高糖飲食、缺乏鍛煉、家族性肥胖可導致肥胖外，人類腸道中的細菌與肥胖的產(chǎn)生也有直接關系[7]。C57BL/6無菌小鼠獲得正常飼養(yǎng)動物的遠端結腸微生物后，雖減少了食物攝入，但在14 d內(nèi)其體脂肪含量和胰島素抗性均增加了60%[8]。肥胖/超重可引起低度炎癥、氧化應激、脂肪組織分泌改變等，進而促成高血壓，所以被認為是血壓升高的危險因素[9]。陰溝腸桿菌屬于革蘭陰性致病菌，被認為是造成肥胖的直接元兇之一，被冠以“肥胖細菌”的稱號。研究發(fā)現(xiàn)當肥胖病態(tài)患者的體質量從初始的174.8 kg減輕到51.4 kg，并伴隨有高血糖和高血壓癥狀的恢復時，陰溝腸桿菌的相對豐度由35%降低到幾乎檢測不到；同時，將此肥胖患者的陰溝腸桿菌導入無菌小鼠并使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)后，相對于對照組小鼠，其體質量迅速增加，體內(nèi)多個器官也累積了更多的脂肪，并出現(xiàn)了胰島素抵抗等肥胖癥相關癥狀[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬細菌的豐度與血壓也有一定相關性：高血壓組腸桿菌屬細菌豐度相對于血壓正常組降低，但是有趣的是此菌豐度在高血壓人群中的超重/肥胖組和體質量正常組中無顯著差別。

圖3 腸道菌群中Z分數(shù)有顯著差異的細菌及它們在2組中的豐度信息H.N. 高血壓體質量正常組；H.O. 高血壓超重/肥胖組Figure 3 Gut bacteria with significant difference in Z score and their abundance in different groups

圖4 2組腸道菌群中功能相對豐度的聚類分析H.N. 高血壓體質量正常組；H.O. 高血壓超重/肥胖組Figure 4 Cluster analysis of functional relative abundance of gut microbiota in 2 groups

副桿菌屬細菌是擬桿菌門的一個菌屬，與腸道疾病關系密切。據(jù)報道，相較于潰瘍性結腸炎患者，正常人腸道中副桿菌屬細菌表達水平較高，提示該菌群的缺失與潰瘍性結腸炎的發(fā)生有關[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides goldsteinii類腸桿菌可以抑制高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的肥胖和代謝紊亂，維持腸道完整性，降低內(nèi)毒素血癥和炎癥。該細菌已被證實與肥胖呈負相關關系[11]。而本研究也發(fā)現(xiàn)副桿菌屬細菌在高血壓超重/肥胖組中豐度則顯著低于高血壓體質量正常組。

據(jù)報道，腸道菌群的改變會影響心血管系統(tǒng)的代謝，可以為心血管疾病的治療帶來新的突變[12]，菌群的改變對于改善患者的高血壓或者超重/肥胖狀態(tài)也起到一定的作用。高血壓大鼠模型及人類臨床試驗Meta分析均顯示，給予益生菌可以降低血壓[13-14]。同時，通過抗生素抑制肥胖小鼠的腸道細菌后，可以明顯改善其糖耐量和胰島素抵抗[15]。這提示我們，通過有效的干預措施可改變高血壓超重/肥胖人群微生物菌群組成，進而影響其體質量和血壓。

本研究還存在一定的局限性。首先，入選隊列人群來自“開灤研究”。“開灤研究”是一項在河北省唐山市開灤社區(qū)進行的前瞻性隊列研究，由開灤集體管理。2006年6月—2007年10月期間，共有101 510名居民（81 110名男性和20 400名女性，年齡在18～98歲）被邀請參加“開灤研究”，超過95%的參與者為漢族人[16]。因此，本研究人群僅包含了中國北方某一地區(qū)的漢族人群。其次，由于參與者嚴格控制年齡及排除標準，所以入選的人數(shù)有限。這對研究結果的普遍性具有一定的影響，還須后續(xù)的大樣本研究加以證實。另外，菌群和高血壓超重/肥胖之間的因果關系須要通過菌群移植實驗進一步驗證。