蒼苓散對輪狀病毒腸炎患兒腸道菌群的影響

陳治珍，梁丹丹，鄭智俊，陳 璟，羅 菲，陳佩文，黃曉利，劉 華，陳曉剛

輪狀病毒（rotavirus, RV）是導致世界范圍內特別是低收入國家嬰幼兒急性腹瀉的主要病原體[1-2]。RV感染所導致的急性胃腸炎，會出現不同程度的腹瀉、嘔吐、發熱等癥狀，嚴重者可引起電解質紊亂、酸堿平衡失調、多器官損害、休克乃至死亡[3-4]。在我國，每年RV腸炎的門診病例高達2500萬例，住院23萬例，死亡3.8～4.7萬例，醫療花費累計近8億元[5]。規范液體療法的推廣使用雖然降低了病死率，但RV腸炎目前仍無特效治療方法，且在低收入國家中，疫苗的有效性也并不理想[6]。近年來，研究發現RV腸炎患兒存在腸道菌群失調[7]，補充益生菌則能減輕腹瀉次數，但起效較慢，對于其是否能有效縮短病程，則有不同結論[8-9]。本研究基于16S rDNA的高通量測序技術，研究小兒腹瀉病的中藥臨床驗方蒼苓散對RV腸炎患兒腸道菌群的影響，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇廣州中醫藥大學第一附屬醫院RV腸炎住院患兒9例作為研究對象。患兒為11～38月齡，平均為21.67月齡。RV腸炎的診斷標準：參照中華醫學會制定的《兒童腹瀉病診斷治療原則的專家共識》[10]，①患兒出現大便性狀改變；②大便次數比平時增多；③膠體金法檢測大便中RV抗原陽性者。納入標準：除滿足上述診斷標準外，尚須滿足以下要求，①大便常規，白細胞≤5個/高倍鏡，紅細胞≤5個/高倍鏡；②大便沙門菌、志賀菌、致病性大腸桿菌培養陰性；③排除心、肝、腎疾病，中樞神經系統疾病及遺傳代謝、內分泌疾病等基礎病史。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備及治療措施 蒼苓散復方煎液由廣州中醫藥大學第一附屬醫院制劑室制備。確定患兒入院前1周未使用抗生素及益生菌，經其父母知情同意后，患兒每日服用上述蒼苓散復方煎液150 ml，配合液體療法（口服補液鹽或靜脈補充3∶2∶1液），療程為5 d。

1.2.2 標本采集及細菌總DNA提取 用無菌標本管分別留取治療前（CM0）與治療后（CM1）第5 d的糞便，不少于2 g，-80 ℃保存備用。4 ℃解凍標本，加入三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（pH8.0），震動5 min，使標本充分混勻。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit（德國Qiagen公司）提取細菌總DNA，用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。

1.2.3 引物設計與合成 16S rDNA擴增選擇區域為V3～V4，通用引物是F341和R806。在通用引物的5'端加上適合HiSeq2500 PE250測序的index序列和接頭序列，完成特異性引物的設計（i5，i7為index區域）：正向引物（5'-3'）AAT GATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCG TCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGA CTCCTACGGGRSGCAGCAG；反向引物（5'-3'）CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTC GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGAC TACVVGGGTATCTAATC。

1.2.4 PCR擴增、產物純化、測序 以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFiHotstart Mix PCR kit（中國艾德科技公司）進行PCR反應。PCR產物檢測后切膠回收，進行文庫質檢、定量，并根據每個樣本數據量按相應比例混合。測序采用HiSeq平臺，得到2×250 bp的Paired-End數據，通過拼接，獲得較長tags序列后進行16S rDNA分析。

1.3 分析方法

1.3.1 可操作分類單元分析 對原始數據進行質控后，用Usearch軟件行去嵌合體和聚類操作，先將序列按照豐度從大到小排序，按97%相似度的標準聚類，得到可操作分類單元（operational taxonomic units, OTU），每個OTU被認為可代表1個物種。對每個標本的序列進行隨機抽平處理，并提取對應的OTU序列。根據序列繪制聚類維恩圖，分析蒼苓散治療前后患者的腸道菌群多樣性。

1.3.2 物種豐度分析 從各個OTU中挑選出豐度最高的1條序列，作為該OTU的代表序列。使用核糖體數據庫計劃（ribosomal database project,RDP）方法，將該代表序列與已知物種的16S rDNA數據庫進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類。根據物種注釋結果，分別在門、綱、目、科、屬分類等級對各個標本做物種相應的柱狀圖，形成物種相對豐度柱狀圖。

1.3.3 單個樣本多樣性分析 利用Qiime軟件計算樣本的Alpha多樣性指數的值，并作出相應的稀釋曲線，對單個樣本中物種多樣性進行分析，包括observed species指數（表示實際觀測到的OTU數量）、chao1指數（估計樣品所含OTU的總數）、香農指數和辛普森指數（估算微生物群落的多樣性，指數越大，多樣性越高）。單個樣本多樣性分析稀釋曲線是用已測得16S rDNA序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個Reads時各Alpha多樣性指數的期望值，然后根據一組n值（一般為一組小于總序列數的等差數列）與其相對應的Alpha多樣性指數的期望值做出曲線。

1.3.4 樣本間多樣性分析

1.3.4.1 UniFrac熱圖分析 通過利用系統進化的信息來比較樣品間的物種群落差異，它對樣品兩兩之間進行比較分析，計算得到樣品間的UniFrac距離矩陣。其計算結果可以作為一種衡量Beta多樣性的指數，其數值越大表示樣品間的差異越大。

1.3.4.2 相似性分析 是一種非參數檢驗，用來檢驗2組組間的差異是否顯著大于組內差異，從而判斷分組是否有意義。

1.3.4.3 多響應置換過程分析 多響應置換過程分析（multi-response permutation procedures, MRPP）用于分析組間微生物群落結構的差異是否顯著的一種分析方法，通常與PCA、主坐標分析（principal coordinates analysis, PCoA）、NMDS等降維圖配合使用。

1.3.4.4 主坐標分析 使用PCoA是一種研究數據相似性或者差異性的可視化方法。它基于由物種組成計算得到的距離矩陣，展示各個樣本或群體之間的差異大小。

1.3.5 顯著性差異分析 通過秩和檢驗找出RV腸炎患兒在蒼苓散治療前（CM0）與治療后（CM1）有明顯差異的物種。

1.4 統計學處理 使用秩和檢驗對不同分組之間進行顯著性差異分析，2組間的差異分析采用R語言stats包的wilcox.test函數，對于2組以上的組間差異分析采用R語言stats包的kruskal.test函數（獨立標本）或friedman.test函數（非獨立樣本），選取秩和檢驗后滿足P＜0.05的結果。

2 結 果

2.1 OTU聚類 以97%相似度的標準聚類，得到292個OTU，其中CM0與CM1標本包含的數目分別為255、227個，2種標本共有的OTU數目為190個（見圖1）。

圖1 OTU 維恩圖Figure 1 OTU Venn diagram

2.2 蒼苓散治療前后腸道菌群結構 對所有OTU進行物種歸類，測得326個界，323個門，312個綱，307個目，295個科，256個屬。圖2、3可知所有標本在門、綱、目、科、屬水平上的物種的豐度比例，即表明優勢菌群。

在門水平上以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）為主要菌群（圖2A）；RV腸炎患兒在蒼苓散治療前（CM0）與治療后（CM1）腸道中菌群優勢物種極其相似，但所占比例不同：CM0優勢菌群所占比例由大到小為厚壁菌門＞放線菌門＞擬桿菌門＞變形菌門；CM1優勢菌群所占比例由大到小為厚壁菌門＞擬桿菌門＞變形菌門＞放線菌門（圖3A）。

綱水平上以擬桿菌綱（Bacteroidia）、Negativicute綱、放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、梭菌綱（Clostridia）為主要菌群（圖2B）；CM0優勢菌群所占比例由大到小為放線菌綱＞Negativicutes綱＞梭菌綱＞擬桿菌綱＞γ-變形菌綱；CM1優勢菌群所占比例由大到小為擬桿菌綱＞γ-變形菌綱＞Negativicutes綱＞放線菌綱＞梭菌綱（圖3B）。

目水平上以擬桿菌目（Bacteroidales）、Selenomonadales目、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、梭菌目（Clostridiales）為主要菌群（圖2C）；CM0優勢菌群所占比例由大到小為雙歧桿菌目＞Selenomonadales目＞梭菌目＞擬桿菌目＞腸桿菌目；CM1優勢菌群所占比例由大到小為擬桿菌目＞腸桿菌目＞Selenomonadales目＞雙歧桿菌目＞梭菌目（圖3C）。

科水平上以擬桿菌科（Bacteroidaceae）、韋榮球菌科（Veillonellaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為主要菌群（圖2D）；CM0優勢菌群所占比例由大到小為雙歧桿菌科＞韋榮球菌科＞擬桿菌科＞腸桿菌科；CM1優勢菌群所占比例由大到小為擬桿菌科＞腸桿菌科＞韋榮球菌科＞雙歧桿菌科（圖3D）。

屬水平上以擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia/Shigella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、韋榮球菌屬（Veillonella）為主要菌群（圖2E）；CM0優勢菌群所占比例由大到小為雙歧桿菌屬＞擬桿菌屬＞大腸桿菌-志賀菌屬＞韋榮球菌屬；CM1優勢菌群所占比例由大到小為擬桿菌屬＞大腸桿菌-志賀菌屬＞雙歧桿菌屬＞韋榮球菌屬（圖3E）。

2.3 單個樣本多樣性分析 樣本物種豐度Alpha多樣性指數稀釋曲線見圖4。通過秩和檢驗分析，蒼苓散治療前后，香濃指數的P值為0.25，辛普森指數的P值為0.25，observed species的P值為0.5，chao1指數的P值為0.91，其差異無統計學意義（P均＞0.05）（表1）。

2.4 樣本間多樣性分析

2.4.1 UniFrac熱圖分析 UniFrac能夠通過對樣本進行聚類分析并計算樣本間距離，判斷樣本物種組成的相似性，樣本越靠近說明2個樣本的物種組成越相似。加權UniFrac在計算距離時考慮了序列的豐度，非加權UniFrac不考慮序列豐度。通過對UniFrac結果的聚類，具有相似Beta多樣性的樣品聚類在一起，反應了樣品間的相似性。蒼苓散治療前、后的聚類分析圖，說明樣品的物種組成相似（見圖5）。

2.4.2 PCoA分析 橫坐標表示第一主坐標成份，括號中的百分比表示第一主坐標成份對樣品差異的貢獻率，縱坐標表示第二主坐標成份，括號中的百分比表示第二主坐標成份對樣品差異的貢獻率。如果2個樣本距離較近，則表示這2個樣本的物種組成較相近。對蒼苓散治療前后的標本PCoA分析顯示，2組間差異無統計學意義（見圖6）。

2.4.3 Anosim分析 橫坐標表示所有樣本以及每個分組，縱坐標表示UniFrac距離的秩。R介于（-1，1）之間，R＞0，說明組間差異顯著；R＜0，說明組內差異大于組間差異，統計分析的可信度用P表示，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。對蒼苓散治療前后的標本Anosim分析顯示，2組間差異無統計學意義（見圖7）。

圖2 標本各分類水平中的豐度柱狀圖各圖中橫坐標為標本編號Figure 2 Abundance profiling of the samples in different phylogenetic levels

2.4.4 物種MRPP分析 統計量（A）值＞0說明組間差異大于組內差異，A值＜0說明組內差異大于組間差異，Observe Delta值越小說明組內差異越小，Expect Delta值越小說明組間差異越小；P＜0.05為差異顯著。蒼苓散治療前后的標本MRPP分析顯示，2組間差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。

圖3 2組標本各分類水平中的豐度柱狀圖各圖中橫坐標為分組編號Figure 3 Abundance profiling of the samples in 2 groups in different phylogenetic levels

2.5 物種分析 蒼苓散治療前患兒的標本中脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、嗜膽菌屬（Bilophila）、隱秘桿菌屬（Faecalibacterium）豐度較高；治療后患兒的標本中乳桿菌目（Lactobacillales）、乳 桿菌科（Lactobacillaceae）、 乳桿 菌屬（Lactobacillus）、豐度較高。通過對樣品均值的秩和檢驗分析發現，2組物種間差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。

3 討 論

小兒以腹瀉癥狀為主，在中醫學中稱為“泄瀉”。中醫理論認為，該病的主要病機為脾困濕盛，故當以運脾化濕為治法，蒼苓散則是治療小兒泄瀉的有效驗方。該方由蒼術、茯苓、陳皮、厚樸、山楂炭、甘草等組成，方中重用蒼術運脾燥濕，宣陽化濁，茯苓淡滲利濕，健脾和中，兩者相合，相輔相成；配陳皮、厚樸芳香化濕，調理氣機；輔以甘草益中焦、和百藥，山楂炭酸斂止瀉，使脾運濕化，升降調和，而清濁得分，以達止瀉之效。有前瞻性、多中心的隨機對照臨床研究證實，該方治療包括RV腸炎在內的小兒急性非感染性腹瀉病有顯著療效[11]，但目前尚未明確其具體作用機制。

圖4 標本物種豐度Alpha多樣性指數稀釋曲線圖橫軸表示抽取的reads數量，縱軸表示相應Alpha多樣性指數的值。圖中一種顏色代表一組樣品，測序條數不能覆蓋樣品時，曲線呈直線上升；測序條數增加到覆蓋樣品中的大部分微生物時，曲線呈現平滑趨勢Figure 4 Rarefaction curves of the Alpha diversity in the samples

近年來，腸道菌群與嬰幼兒RV感染的關系得到重視。研究發現，RV腸炎患兒與同齡健康嬰幼兒的腸道菌群間存在顯著差異，表現為多樣性降低，感染后恢復期的穩定性下降，某些特定菌群也有較大不同，如變形菌門（Proteobacteria）的豐度增高，而厚壁菌門（Firmicutes）的豐度則降低等[7]。最近的研究結果還提示，嬰幼兒接種RV疫苗的成功率與腸道菌群相關，特別是變形菌門中的沙雷菌屬（Serratia）和腸桿菌屬（Escherichia coli）在疫苗無反應者的腸道中豐度顯著低于有反應者，而這些菌屬可通過鞭毛和內毒素的途徑等，影響機體的免疫反應，這可能是低收入國家人群中疫苗有效性不佳的重要原因[12]，但這種腸道菌群間的差異是否是食物、衛生環境或宿主因素所導致的，目前尚無研究結論。

表1 樣品Alpha多樣性統計結果Table 1 Statistical results of the Alpha diversity in the samples

圖5 Beta多樣性熱圖A. 加權UniFrac；B. 非加權UniFracFigure 5 Heat map of Beta diversity in the samples

圖6 2組標本主坐標分析圖A. 加權的UniFrac結果；B. 非加權的UniFrac結果；圖中各點分別表示各個樣品，不同顏色代表樣品屬于不同的分組Figure 6 Principal co-ordinates analysis of the main samples in 2 groups

圖7 2組標本相似性分析圖A. 加權Unifrac結果；B. 非加權Unifrac結果Figure 7 Anosim analysis of the samples in 2 groups

表2 MRPP 2組間差異分析Table 2 MRPP differential analysis between 2 groups

表3 2組間差異顯著物種列表Table 3 The significant different species between 2 groups

本項研究利用基于16S rDNA的高通量測序技術，對蒼苓散治療前后患兒的腸道菌群進行了比較，發現2者在門水平上均以厚壁菌門的豐度為最高。治療后（CM1）腸道菌群中乳桿菌科、乳桿菌目與乳桿菌屬均較治療前（CM0）顯著增多（P＜0.05）。乳桿菌是人和哺乳動物腸道內的重要益生菌，研究發現乳桿菌制劑——Lactobacillus rhamnosus GG能改善腸道免疫功能，提高RV感染后小豬空腸黏膜內的sIgA水平[13]，減輕RV感染嬰幼兒及實驗動物的腹瀉癥狀[13-14]。既往以熒光定量PCR檢測法的研究也發現，蒼苓散治療后RV腸炎患兒sIgA含量的升高與乳桿菌之間呈顯著的正相關[15]，進一步提示中藥可能通過影響腸道相關益生菌如乳桿菌的功能而起治療作用。

此外，本項研究結果中，用香農指數、辛普森指數所估算的微生物群落多樣性，UniFrac聚類分析判斷的物種組成相似性，以及PCoA、Anosim分析及物種MRPP分析等，均未能發現蒼苓散治療前后患兒的腸道菌群結構存在顯著差異，這可能與樣本量小及觀察治療的時間較短有關。此外，研究原設計有益生菌對照組，但可能因為近幾年RV疫苗的推廣使用，嬰幼兒RV腸炎的發病率顯著下降，故未能采集到足夠病例，今后需要更大樣本、更深入的對照研究，以進一步明確中醫藥治療嬰幼兒RV腸炎的腸道菌群具體機制。