鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)率提升的研究

黃靖 劉春英 袁亞芳

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;原球莖;誘導(dǎo);培養(yǎng)基

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.002

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo又稱黑節(jié)草，屬蘭科石斛屬，為蘭科多年生附生草本植物，是一種珍貴的野生藥用植物。石斛屬DendrobiumSw是蘭科Orchidaceae中的第二大屬，迄今全球已發(fā)現(xiàn)有1500多種植物，我國有70多個(gè)種。現(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用，因此在臨床上及中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用[1]。鐵皮石斛蒴果成熟時(shí)易開裂，且種子粒徑小，自然繁殖率低。由于鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過度采挖破壞，自然資源瀕臨枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種。近年來，在鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的推動(dòng)下，大多數(shù)從事鐵皮石斛組織培養(yǎng)的企業(yè)，主要是采用種子播種方式。由于使用的果莢沒有嚴(yán)格把關(guān)，生產(chǎn)出來的種苗分化、混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，種植出來的鐵皮石斛品質(zhì)無法得到保證，嚴(yán)重影響了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，為了保護(hù)和有效利用鐵皮石斛，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。

組培工廠化生產(chǎn)育苗要求配方穩(wěn)定、繁殖系數(shù)高、成本低和種苗質(zhì)量穩(wěn)定[2]。目前有關(guān)鐵皮石斛快速繁殖研究報(bào)道中，多集中以種子、莖尖、莖段等為外植體，并通過原球莖的增殖與分化來繁殖種苗[3]。

通過莖段原球莖的途徑，生產(chǎn)出的種苗都來源于同一母本，性狀整齊一致，可以解決種子播種的種苗混雜問題，且繁殖系數(shù)高;但是，原球莖誘導(dǎo)的控制難度較大，生產(chǎn)上沒有得到廣泛應(yīng)用[4]。以鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖，再通過原球莖的分化、增殖培養(yǎng)而得到大量幼苗，這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度，推進(jìn)工廠化育苗[5]。本研究以福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司的鐵皮石斛種子、莖段為原材料，采用單因素試驗(yàn)法對(duì)原球莖的誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選，以期建立一整套鐵皮石斛莖段原球莖途徑的組培生產(chǎn)技術(shù)流程，應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自福清佳家農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，種植于基地溫室大棚。

1.1.1莖段的處理選擇健康、無病蟲害為害的當(dāng)年生鐵皮石斛嫩莖，去除葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2成熟蒴果的處理采集鐵皮石斛成熟蒴果，經(jīng)過表面消毒處理，剖開蒴果取出種子接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1莖段消毒莖段先用自來水沖洗干凈，再用流水沖洗5 min，然后用無菌濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺(tái)上，將莖段剪成3 cm長的小段，每段帶1～2個(gè)莖節(jié)。先用75%酒精浸泡30 s，再放入0.1 L汞溶液中浸泡6 min;之后用無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干，在無菌碟子上切去兩端傷口，并切成帶一個(gè)節(jié)的小段，接種到不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2蒴果的消毒將鐵皮石斛的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時(shí)，將經(jīng)過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.3原球莖的誘導(dǎo)莖段及種子均以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置8個(gè)處理，分別添加不同濃度的NAA（表1）。將材料接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)外植體，30 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的誘導(dǎo)情況。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體及激素對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

接種10 d起，外植體均開始萌發(fā)，30 d左右可明顯看到膨大的原球莖，且部分原球莖開始分化出芽尖。60 d左右可明顯看到分化出的小苗。

由表3可以看出，不同處理種子均可萌發(fā)誘導(dǎo)出原球莖，而以種子為外植體的原球莖誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于以莖段為外植體的誘導(dǎo)率，其中以MS為基本培養(yǎng)基處理原球莖誘導(dǎo)率均高于以1/2MS為基本培養(yǎng)基處理。MS添加NAA 0.1 mg·L-1處理的原球莖誘導(dǎo)率高達(dá)98.7%，處理4的誘導(dǎo)率最低，為41.6%。由此可以看出，NAA濃度過高抑制幼苗分化，而低濃度NAA有利于促進(jìn)幼苗分化。

綜合原球莖誘導(dǎo)和分化情況可知，MS中添加0.1 mg·L-1 NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)和發(fā)育。

2.2不同激素濃度對(duì)原球莖增殖的影響

從表4可以看出，鐵皮石斛的原球莖體具有較強(qiáng)的增殖能力。即使只在基本培養(yǎng)基中，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，其增殖系數(shù)仍可高達(dá)21.4。在添加NAA 0.1 mg·L-1的條件下，6BA的最佳用量為0.5 mg·L-1，即處理③，鐵皮石斛原球莖體的增殖系數(shù)高達(dá)45.8。該處理中每瓶接入5個(gè)原球莖體，經(jīng)60 d培養(yǎng)后，最多的1瓶增殖出的原球莖體數(shù)多達(dá)297個(gè)，統(tǒng)計(jì)5瓶，共增殖出2290個(gè)原球莖體。繼續(xù)增加6BA用量后，原球莖增殖系數(shù)反而下降，當(dāng)6BA用量達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)開始下降至34.9。

3結(jié)果與討論

原球莖誘導(dǎo)是鐵皮石斛原球莖途徑組織培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，誘導(dǎo)率的高低直接影響組培工廠化生產(chǎn)的成本。常規(guī)組培手段采用的原球莖誘導(dǎo)多使用鐵皮石斛莖段及莖尖為外植體，誘導(dǎo)率普遍低于50%，本研究通過接種成熟種子對(duì)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)，在MS+NAA 0.1 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0g·L-1上，鐵皮石斛成熟種子萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖比率高達(dá)98.7%。在MS+NAA 0.1 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1上，原球莖能大量進(jìn)行增殖。試驗(yàn)結(jié)果也表明添加一定濃度的生長素和細(xì)胞分裂素能有效促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)，但濃度過高或過低均不利于原球莖的誘導(dǎo)及增殖。

組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種，關(guān)于利用成熟種子進(jìn)行快繁，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是用成熟的種子消毒后進(jìn)行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖、分化發(fā)育成完整植株[5]。本研究主要是采用將種子消毒后無菌播種誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，增殖原球莖，再通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基促進(jìn)小苗增殖的方法，進(jìn)而達(dá)到快繁的目的。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）