花葉金線蓮試管工藝制作技術(shù)

葉秀仙 陳藝荃 樊榮輝 吳建設(shè) 鐘淮欽

摘要：花葉金線蓮為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所自主選育的金線蓮新品種，其葉色墨綠色與金黃色相嵌，形成鮮明的色彩對比，色澤亮麗，具有較高的觀賞價值，特別適合于試管花卉的開發(fā)應(yīng)用。從無菌材料獲得、培養(yǎng)容器選擇與滅菌、培養(yǎng)基配制與滅菌分裝、試管工藝接種培養(yǎng)等方面總結(jié)了花葉金線蓮試管工藝制作技術(shù)。

關(guān)鍵詞：花葉金線蓮;試管花卉;工藝制作

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.001

金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，也是十分珍貴的室內(nèi)小型觀葉植物[1-4]。花葉金線蓮是從福建金線蓮組培快繁中發(fā)現(xiàn)的突變單株，經(jīng)定向選擇而育成的新品種，其葉色墨綠色與金黃色相嵌，形成鮮明的色彩對比，色澤亮麗，具有較高的觀賞價值，特別適合于試管花卉的開發(fā)應(yīng)用。本文從其組培快繁、試管工藝制作規(guī)程等方面總結(jié)了花葉金線蓮試管工藝制作技術(shù)。

1基本設(shè)備要求

1.1試驗場所

環(huán)境清潔、空氣干燥的實驗室，主要包括化學(xué)實驗室、洗滌室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室等。

1.2儀器設(shè)備

主要有高壓滅菌鍋、超凈工作臺、藥品柜、冰箱、電磁爐、電子天平、攪拌器、pH計、空調(diào)、培養(yǎng)架、紫外線燈、培養(yǎng)瓶、工藝瓶、常用玻璃儀器、手術(shù)刀、鑷子等，以及所需的化學(xué)試劑。

1.3培養(yǎng)條件

根據(jù)培養(yǎng)目的進行調(diào)控，培養(yǎng)溫度一般保持在（25±2）℃;光照強度根據(jù)培養(yǎng)目的和培養(yǎng)階段進行調(diào)控，母瓶材料繁殖一般為1500～2000 lx，試管工藝產(chǎn)品預(yù)培養(yǎng)一般為1000～1500 lx;光照時間10 h·d-1。

2組培快繁

2.1外植體制備

花葉金線蓮系誘變獲得的新材料，資源保存主要有通過移栽種植活體保存與母瓶材料無菌保存2種方式。若選取活體保存的材料需重新建立無菌系。外植體制備方法：選取健康、無病蟲害的母株，去除葉片、根系，留下莖段，先用洗潔精溶液浸泡5 min，再用自來水沖洗干凈，移至超凈工作臺上;先用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%HgCl2滅菌8～10 min后取出，用無菌水徹底沖洗 4～5 次，備用。

2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒后的外植體切割成帶節(jié)莖段（長度1 cm）接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后莖段節(jié)結(jié)處的潛伏芽開始萌動膨大，培養(yǎng)10～15 d后可觀察乳白色主芽形成，隨后主芽基部發(fā)生一級側(cè)芽，一級側(cè)芽可發(fā)生二級側(cè)芽，二級側(cè)芽又可發(fā)生三級側(cè)芽……從而形成主軸分枝型的叢生芽。

2.3增殖培養(yǎng)

以誘導(dǎo)出的主軸分枝型的叢生芽為材料，以主軸分枝型的叢生芽增殖途徑實現(xiàn)不斷增殖。繼代增殖培養(yǎng)周期控制在50～55 d，增殖系數(shù)控制在3.0～4.0。培養(yǎng)周期過長芽苗易伸長，不利于增殖培養(yǎng)與試管工藝制作。

3試管工藝制作

3.1培養(yǎng)容器選擇與滅菌

3.1.1培養(yǎng)容器選擇采用球型玻璃工藝瓶或藝術(shù)化的玻璃器皿均可，在選擇球型玻璃工藝瓶作為培養(yǎng)容器時，要考慮培養(yǎng)基固定問題，即瓶底不能滑動，否則會影響造景美觀效果。

3.1.2培養(yǎng)容器滅菌花葉金線蓮主要以直徑8 cm的球型玻璃瓶作為培養(yǎng)容器，先用牛皮紙包裹球型玻璃瓶，后裝入保鮮袋，封口后，放入高壓滅菌鍋121℃下滅菌40 min，滅菌后在溫度80℃的干燥箱中充分干燥，備用。

3.2培養(yǎng)基制備

3.2.1母液配制分為大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、有機化合物母液、食用色素母液和抗菌劑母液。根據(jù)花葉金線蓮所需的培養(yǎng)基組分（表1），先將母液配制為以下濃度：（1）大量元素母液為20的倍數(shù)關(guān)系;（2）微量元素母液為200的倍數(shù)關(guān)系;（3）鐵鹽母液為100的倍數(shù)關(guān)系;（4）有機化合物母液為100的倍數(shù)關(guān)系;（5）抗菌劑母液濃度為1.0 mg·mL-1;（6）食用色素母液濃度配為1.0 mg·mL-1;配制培養(yǎng)基所用試劑純度為化學(xué)純以上。配制用水除無機化合物母液使用無菌的蒸餾水外，其余均用去離子水配制。將配置好的母液貼上標(biāo)簽，標(biāo)明母液名稱、濃度和配制日期。微量元素母液和鐵鹽母液用棕色瓶儲藏。母液

置于4℃左右的冰箱中，儲藏時間不超過1個月。母液若有沉淀、結(jié)晶、微生物和藻類生長應(yīng)廢棄不用。

3.2.2培養(yǎng)基配制、滅菌與分裝依照花葉金線蓮試管工藝培養(yǎng)基配方（表1）以及需要配制的培養(yǎng)基體積，量取70%最終體積的蒸餾水，按比例分取大量元素、微量元素、鐵鹽、有機化合物及食用色素、抗菌劑母液，稱取所需的固化劑、花寶1號和糖等，轉(zhuǎn)至不銹鋼加熱容器內(nèi)。邊加熱邊攪拌，控制沸騰程度，直至固化劑和糖完全溶解后，將培養(yǎng)基定容至最終所需體積。用1.0 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)整培養(yǎng)基pH值至5.8左右。

將配置好的培養(yǎng)基裝入650 mL的組培瓶4/5處，旋緊瓶蓋，放入高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20 min，滅菌后取出冷卻至45～50℃，待分裝。

在超凈工作臺上，拆開已滅菌過的工藝球型玻璃瓶，置于臺面上，用高溫滅菌過的燒標(biāo)量取培養(yǎng)基40 mL，再用無菌漏斗注入球型瓶口，封緊瓶塞，然后靜置冷卻、凝固。

3.3接種

3.3.1準(zhǔn)備工作（1）接種人員保潔。接種操作人員進入接種室前，在緩沖間更換拖鞋，穿接種服，戴帽子、口罩，用洗潔劑洗凈手。（2）物品滅菌。接種器械、接種盤等物品使用前應(yīng)進行滅菌， 滅菌方法：用牛皮紙包裹后裝入保鮮袋放入高壓滅菌鍋于121℃下滅菌40 min，備用。（3）接種室滅菌。接種人員先打開超凈工作臺、接種室和緩沖間的紫外燈進行滅菌30 min，在關(guān)閉紫外燈15 min后人員方可進入接種室;接種人員對超凈工作臺上的工具、臺面和兩側(cè)擋板用75%酒精或0.1%新潔爾滅進行擦拭滅菌，滅菌后對超凈工作臺開機通風(fēng)30 min;在開始接種前15 min打開接種用電熱滅菌器。

3.3.2接種用棉花球制作與滅菌無菌干燥的棉花球制作方法：配置質(zhì)量濃度為8%的表面活性劑溶液，可使用市售立白洗潔精與蒸餾水按比例配制而成，將脫脂棉浸泡其中后，擠出水分，在溫度80℃的干燥箱中充分干燥，將干燥后的棉花做成直徑0.8～1.0 cm的小棉球，并在121℃滅菌40 min即得無菌干燥的棉花球，其制作原理是表面活性劑可以減少水在玻璃瓶內(nèi)的張力，使其流下不在瓶壁上聚集。

3.3.3接種操作（1）消毒。接種人員在接種操作前用75%酒精噴灑臺面，酒精棉徹底擦拭雙手及臺面。（2）滅菌。接種操作過程要對接種的工具（鑷子、切割刀、接種盤等）進行滅菌，在接種前應(yīng)高壓滅菌鑷子、切割刀、接種盤，用時在接種器具殺菌器中消毒，插入280～290℃的導(dǎo)熱石英珠殺菌筒中15～20 s，便可完成殺菌過程，消毒后的切割刀、鑷子放在專用插槽或擱置架上，待冷卻后使用。使用過的接種工具要重新滅菌后晾放備用，避免交叉污染。（3）接種方法。A.無菌試管苗切割：在超凈工作臺上，打開母瓶材料瓶口時應(yīng)拿成斜角，以免灰塵落入瓶中;用鑷子取出瓶中的材料放入接種盤中，右手拿切割刀，左手拿鑷子，將取出的材料進行切割，切割成1～3芽，備用。B.用無菌干燥的棉花球擦拭球型玻璃瓶壁上的水珠或水汽，使瓶壁透亮;然后將長勢一致的花葉金線無菌試管苗接種至工藝玻璃瓶中的培養(yǎng)基上，接種數(shù)為3個芽，芽以斜插或直插方式植入培養(yǎng)基2/3深處，并進行造型布局，接種后及時蓋好瓶蓋。

3.3.4接種后處理關(guān)閉接種器具殺菌器、清潔超凈工作臺和接種室，最后關(guān)閉超凈工作臺及電源 。

3.4工藝品培養(yǎng)

將接有無菌試管苗的工藝玻璃瓶放置在溫度（25±2）℃、光照強度1500～2000 lx、光照時間為10 h·d-1的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為21～28 d，之后轉(zhuǎn)入室溫、散射光條件下繼續(xù)培養(yǎng)即可。

參考文獻：

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（責(zé)任編輯：陳文靜）