烏梅的1H—NMR指紋圖譜研究

唐榮偉 田玫瑰 唐玲 杜歡 范剛 潘正

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2644-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.12

摘 要 目的：為烏梅的質量控制以及功效物質的全面檢測和開發利用提供參考。方法：以氘代甲醇-重水（1 ∶ 0.3，V/V）為提取溶劑，在25 ℃下采用標準的預飽和脈沖序列（ZGPR）壓制水峰建立10批不同來源烏梅藥材的氫核磁共振（1H-NMR）指紋圖譜，通過“加標準品定性”試驗、數據庫比對和相關文獻比對進行信號歸屬，采用相關系數法計算10批不同來源烏梅藥材1H-NMR指紋圖譜的相似度，并采用主成分分析（PCA）法進行藥材的質量評價。結果：從烏梅藥材中同時檢測出19種化合物，包括綠原酸、檸檬酸、丁二酸、乙酸、丙氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸等。其中，乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸為首次從烏梅藥材中檢測到。10批烏梅藥材指紋圖譜的相似度均>0.9，平均為0.974。 PCA結果顯示，前兩個主成分的累積貢獻率為90.3%，與相似度評價結果基本一致。結論：建立的1H-NMR方法具有整體性和分析快等優點，可為烏梅的質量控制和功效物質的全面檢測提供參考。

關鍵詞 烏梅；氫核磁共振；指紋圖譜；主成分分析；質量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for the quality control of Prunus mume， comprehensive detection， development and utilization of active ingredients. METHODS： Using deuterated methanol and deuterium oxide （1 ∶ 0.3， V/V） as extracting solvent， 1H-NMR fingerprints of 10 batches of P. mume from different sources were established by standard presaturated pulse sequence （ZGPR） at 25 ℃. The signal was assigned through “adding standard substance qualitation” trial， database comparison and related literature comparison. The similarity of 1H-NMR fingerprints was calculated for 10 batches of P. mume from different sources by using correlation coefficient method. The quality of medicinal material was evaluated by principal component analysis （PCA）. RESULTS： A total of 19 compounds were detected in P. mume， among which chlorogenic acid， citric acid， succinic acid， acetic acid， alanine， valine， γ-aminobutyric acid， etc. Among them， acetic acid， γ-aminobutyric acid and succinic acid were detected for the first time. Moreover， the similarity of 1H-NMR fingerprinting of 10 samples was higher than 0.9， being 0.974 in average. The results of PCA showed that accumulative contribution rate of former 2 main components was 90.3%， which was consistent with the similarity evaluation. CONCLUSIONS： The established 1H-NMR method has the advantages of embodying integrity and rapid analysis， and can provide reference for the quality control of P. mume， and comprehensive testing of active ingredients.

KEYWORDS Prunus mume； 1H-NMR； Fingerprint； Principal component analysis； Quality control

烏梅又名酸梅、梅實，始載于《神農本草經》，為薔薇科植物梅[Prunus mume （Sieb.） Sieb.et Zucc.]的干燥近成熟果實。烏梅具有較高的營養和藥用價值，已入選國家衛生和計劃生育委員會藥食兩用名單（2002年版）。2015年版《中國藥典》（一部）記載，烏梅有斂肺、澀腸、生津、安蛔的功效，可用于治療肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱消渴、蛔厥嘔吐腹痛等[1]。現代藥理學研究表明，烏梅具有明顯的抗菌、降血脂、鎮靜、抗肝纖維化等生物活性[2]。可見，烏梅具有較好的開發利用價值和發展前景。烏梅在全國各地均有栽培，主產于四川、貴州、福建等地。研究表明，烏梅中主要含有齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分（次生代謝產物），以及檸檬酸、蘋果酸、乳酸等有機酸類成分和氨基酸類、糖類等成分（初生代謝產物）[3]。目前，已有文獻開展了烏梅藥材中特征化學成分的高效液相色譜（HPLC）法含量測定研究[4-5]。然而，常規HPLC測定方法大都只能分析幾個或某一類成分，很難同時分析屬于不同類型的化學成分。

近年來，隨著儀器及信號處理技術的發展，核磁共振方法的準確度和重復性得到極大提高。氫核磁共振（Hydrogen-1 nuclear magnetic resonance，1H-NMR）分析技術具有體現整體性、無偏向性、分析快速等特點[6-7]，廣泛應用于中藥的品種鑒定、質量控制及道地性評價等[8-12]。1H-NMR技術提供了一個整體、宏觀的分析平臺，能同時檢測藥材中的整體化學成分，有利于提高中藥的質量控制和評價水平[8]。本研究參考烏梅藥材中已發現的化學成分[3]，充分利用1H-NMR分析技術的方法學優勢，首次從整體上檢測分析烏梅中的初生和次生代謝產物，建立1H-NMR指紋圖譜，以期為烏梅的質量控制及功效物質的全面檢測和開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

400 MHz型核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；BP221S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

本研究共收集了10 批烏梅藥材樣品（藥材來源見表1），經成都中醫藥大學民族醫藥學院范剛副研究員鑒定均為薔薇科植物梅P. mume的干燥近成熟果實；綠原酸對照品（批號：110753-200413，純度：98.5%）、齊墩果酸對照品（批號：110709-200505，純度：98.7%）、熊果酸對照品（批號：110742-200517，純度：98.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；氘代甲醇（CD3OD）、重水（D2O）、3-（三甲基硅基）-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉鹽（TSP）均購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）購自成都市科龍化工試劑廠；蘋果酸對照品（批號：M0020，純度：99.0%）、酒石酸對照品（批號：T0001，純度：99.0%）、抗壞血酸對照品（批號：A0537，純度：99.0%）、乳酸對照品（批號：L0226，純度：98.5%）、檸檬酸對照品（批號：C1949，純度：98.0%）均購自成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 1H-NMR測定條件

測定溫度為25 ℃；觀察頻率為400.13 MHz；脈沖延遲時間為2 s；譜寬為6 393.9 Hz；采樣時間為2.56 s，采樣次數為64次；以CD3OD為頻率內鎖，并采用標準的預飽和脈沖序列（ZGPR）壓制水峰信號。

2.2 數據處理

將測得的1H-NMR信號導入MestReNova軟件進行傅里葉轉換，調整相位和基線，以TSP（0 ppm）為基準校正化學位移。以0.04 ppm為單位對0.50～8.50 ppm范圍的圖譜進行分段積分，并以總峰面積為參照進行歸一化處理，得到各化學位移段與之相對應的信號峰面積值，扣除屬于甲醇的信號（3.28～3.32 ppm）及水峰信號（4.86～4.94 ppm），用最終得到的數據進行統計分析。

2.3 供試品溶液的制備

取干燥的烏梅藥材粉末0.2 g，置于錐形瓶中，分別加入1 mL的 CD3OD溶液和 0.3 mL的 D2O溶液（內含12.32 mg/mL的KH2PO4和0.04% TSP），混勻，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，取出，濾過，取0.6 mL 續濾液至核磁管中，按照上述的1H-NMR條件進行測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一烏梅供試品（批號：WM-1）溶液，在上述1H-NMR條件下連續測定5次，依法處理得到積分數據后，利用Excel軟件計算5次測定的相關系數，結果分別為0.999、0.997、0.998、0.998和0.996，均大于0.9，表明精密度良好[13]。

2.4.2 重復性試驗 取同一批次烏梅藥材（批號：WM-1）粉末5份，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，分別進行1H-NMR測定和數據處理后，利用Excel軟件計算相關系數，結果分別為0.998、0.995、0.996、0.999和0.997，均大于0.9，表明重復性良好[13]。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品（批號：WM-1）溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、8、12、24 h，分別進行1H-NMR測定和數據處理后，利用Excel軟件計算相關系數，結果分別為0.994、0.995、0.998、0.994、0.991和0.992，均大于0.9，表明室溫條件下放置24 h供試品溶液穩定[13]。

2.5 烏梅化學成分的1H-NMR檢測及信號歸屬

取同一批次（批號：WM-1）烏梅藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述波譜條件下進行1H-NMR測定。采用“加標準品定性”試驗進行齊墩果酸、綠原酸、酒石酸、熊果酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸等7種成分的1H-NMR信號歸屬。此外，通過比對數據庫及參考相關文獻[6]進行氨基酸、糖類等成分的1H-NMR信號歸屬。最終，從烏梅藥材樣品中共鑒定出了19種化合物，包括綠原酸、乳酸、檸檬酸（枸櫞酸）、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、丁二酸、乙酸、丙氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、脂肪酸類和甾醇類等。其中，乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸為首次從烏梅樣品中檢測到。烏梅藥材代表性的1H-NMR圖譜見圖1[為了清晰地指明各化學成分的歸屬情況，特以NMR圖譜的高場區（0.0～2.7 ppm）、中場區（2.8～4.7 ppm）和低場區（4.8～8.2 ppm）分別進行展示]，19種鑒定化合物的特征信號化學位移及多重態見表2。

2.6 1H-NMR指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批烏梅藥材樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述1H-NMR條件進樣測定后，通過MestReNova軟件比對各批次藥材的1H-NMR圖譜，確定共有峰，并進行信號歸屬和化學成分鑒定，最終建立10批烏梅藥材的1H-NMR特征指紋圖譜。以不同批次樣品的積分面積為數據，以相關系數為測度，通過中位數矢量法計算得出多個1H-NMR圖譜的共有模式（對照圖譜R），并以此共有模式為基準，利用Excel軟件計算10批烏梅藥材樣品的相似度。結果，10批烏梅藥材1H-NMR指紋圖譜的相似度均大于0.9，平均相似度為0.974，表明不同來源烏梅藥材間的總體1H-NMR圖譜相似。其中，樣品WM-2、WM-7、WM-10的相似度相對較低，提示這3批樣品與其他樣品有一定的差異。10批烏梅藥材的1H-NMR指紋圖譜見圖2，相似度評價結果見表3。

2.7 主成分分析

為了進一步評價不同來源烏梅藥材的質量，將不同批次樣品的1H-NMR數據導入SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析。數據采用中心化方法（Mean-centering and not scaling）進行尺度同一化處理。結果，前兩個主成分的累積貢獻率為90.3%[第一主成分的貢獻率為73.2%，第二主成分的貢獻率為17.1%]。樣品WM-1、WM-4、WM-5、WM-6、WM-8聚為一類，表明這5批樣品的化學成分更加相似；其他批次樣品聚為一類，其中樣品WM-2離中心點最遠，表明其質量差異最大。主成分分析研究結果與相似度評價結果基本一致，表明所建立的1H-NMR指紋圖譜結合多元統計分析方法可用于烏梅藥材的質量控制和評價。主成分分析的二維得分圖見圖3。

3 討論

目前，基于1H-NMR分析技術的中藥質量控制及評價采用的提取溶劑主要有水、甲醇、含水甲醇、氯仿等[8]，每種溶劑均有其獨特的提取效果，實際應用中應根據目標成分的極性大小選擇最佳的提取溶劑。在前期研究中筆者分別考察了CD3OD-D2O、CD3OD、CDCl3和D2O作為提取溶劑的提取效果。結果，以D2O為提取溶劑時主要提取出了檸檬酸和糖類成分，以CDCl3為提取溶劑時可提取出更多低極性的脂肪酸類成分，但是兩者對綠原酸、齊墩果酸等成分的提取效果均不好；以CD3OD和CD3OD-D2O為提取溶劑能夠得到更多的次生代謝產物，但CD3OD對醋酸、糖類和氨基酸類成分的提取效果又相對較差。為了盡可能地提取烏梅中多種類型的的化學成分，故最終選擇以CD3OD和D2O的混合溶劑（1 ∶ 0.3，V/V）進行藥材提取。此外，為了防止由于化學成分濃度差異所引起的化學位移變化，特加入一定量的KH2PO4緩沖鹽控制樣品溶液的pH值。

烏梅藥材含有多種生物活性成分，如齊墩果酸、熊果酸、檸檬酸等[3]。由于這些成分的極性相差較大，采用HPLC等常規方法很難通過單次檢測就同時分析出不同類型的化學成分，不能反映烏梅的整體質量和功效價值。本研究采用體現整體性的1H-NMR分析技術，首次同時檢測并分析了烏梅的整體化學成分，鑒定了包括五環三萜類、有機酸類、糖類等在內的19種成分，并首次發現了烏梅藥材中含有乙酸、γ-氨基丁酸和丁二酸這3種成分。本研究檢測出的蔗糖、葡萄糖、丙氨酸、抗壞血酸為人體需要的基本營養物質；而γ-氨基丁酸具有降血壓、提高免疫力、延緩衰老等生理功能[14]；蘋果酸能有效提高運動能力，并可抗疲勞和抗氧化[15]；綠原酸具有保護心腦血管、抗糖尿病及免疫調節等作用[16]；齊墩果酸和熊果酸具有改善胰島素抵抗及調節血脂等多種生物活性[17]。

本研究結果表明，1H-NMR分析技術單次檢測就能同時分析烏梅樣品中的有機酸類、五環三萜類、糖類等活性成分，反映了烏梅藥材的內在質量和藥用價值。本文所建立的1H-NMR方法具有體現整體性、重復性好、分析快速等優點，可為烏梅內在質量的控制和整體效應物質的全面檢測奠定基礎。

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（收稿日期：2018-05-28 修回日期：2018-08-05）

（編輯：林 靜）